脂肪酶活性条件试验设计

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1、脂肪酶活性条件试验设计脂肪酶的最适温度测定试验 一、目的：测量脂肪酶的最适反应温度 二、原理：脂肪酶能分解脂肪产生脂肪酸，使得反应液 ph 下降，用 0.01mol/LNaOH 溶液 中和所产生的脂肪酸，所消耗的 0.01mol/LNaOH 溶液体积与酶的活性成正相关性。不同温 度下，酶的活性与温度的关系可以通过 0.01mol/LNaOH 溶液体积间接反映出来。 三、方法：为保证测量结果的准确，脂肪酶的最适反应温度试验在国标里脂肪酶的活性测 定的检验方法基础上改动震荡水浴温度，其余尽量保持不变。 四、检测步骤： 酶活的测定（NaOH 滴定法） 固体：精密称取固状酶粉 0.500g，放入小烧杯

2、中，用约 50ml 缓冲液溶解，磁力搅拌 15-20 分钟，转移至 100ml 容量瓶中，用缓冲液都次冲洗烧杯，同时转移到容量瓶中， （注意不 要起泡） ，定容至刻度，振摇 1 分钟左右，静置 20 分钟以上，取上清液再次进行下一步稀 释，稀释倍数：以样品与对照消耗碱量之差在 4.5-5.5ml 范围内。 液体：准确吸取 1ml 样品于 100ml 容量瓶中，用缓冲液定溶到刻度，摇匀，进行下一步稀 释，稀释倍数：以样品与对照品之差在 4.5-5.5ml 范围内。再次稀释不得超过两次。 测定：取 100ml 三角瓶 3 只，其中 2 只是试样，1 只是空白对照，每杯中的组成液为： 4.0ml 缓

3、冲液（pH9.4） ，5.0ml 橄榄油乳化液，1.0ml 酶液。以上除酶液以外的组成液置于 20 摄氏度水浴锅预热 5 分钟，然后精确加入 1ml 酶液，精确计时，缓慢震荡（80 次每分 钟） ，保温 10 分钟，立即加入 95%酒精 20ml，取出，加入 10ml30%氯化钠溶液，摇匀，使 之破乳约 1 分钟，并同时做空白对照，对照同样品一样，先预热 5 分钟，保温 10 分钟，立 即加入 20ml95%酒精（1ml 酶液先加入该 20ml95%酒精灭活） 。 用 0.01mol/NaOH 滴定样品至空白溶液的 pH。反应后的样品应在半小时内完成滴定。 通过计算算出酶的活性，记录结果。 将

4、水浴锅分别设定为 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 摄氏度，重复以上试验。 五、结果数据： 酶的最适温度（）温度（单位： 摄氏度）稀释倍数消耗碱液体积酶的活性值备注2025303540455055606570总结脂肪酶的最适 pH 测定试验一、目的：测定脂肪酶的最适反应 pH 值 二、原理：在特定的温度和特定的反应时间里，酶的活性与所产生的脂肪酸成正相关性， 酶在不同的 PH 环境下的活性差别与所产生的脂肪酸的含量成正相关性，因此，可以通过 酶催化反应前后的酸度变化以及滴定反应液至反应前的 ph 浓度和通过消耗掉的 0.01mol/L 的 NaOH 溶液体积的大小来判

5、断最适的 ph 值。三、方法：选择对脂肪酶催化有惰性的缓冲液，利用盐酸或者氢氧化钠滴定至所需的酸度，用此酸度的缓冲溶液替换国标“脂肪酶活性测定”里的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液来与橄榄油-PVA 乳化液混合，并再次滴定校正 pH 至所需酸度。不同 PH 段选择不同的缓冲液，其中pH=45 的时候选择 0.05mol/L 甘氨酸-盐酸缓冲液（缓冲范围 2.2-5.0），pH=68 的时候选用 0.05mol/L 磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液（缓冲范围 5.8-8.0），pH=8.610 的时候选择 0.05mol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(缓冲范围 8.6-10.6)，pH=1112 的时候选择0.0

6、5mol/L 磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液（缓冲范围 10.9-12.0）。四、试验过程：酶水解反应缓冲液配制：取浓度为 0.05mol/L 的甘氨酸-盐酸缓冲液 400ml 分置与两个烧杯，用 0.05mol/L 的盐酸分别滴定至 pH=4 和 pH=5，备用。取浓度为 0.05mol/L 的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液 600ml,分置于三个烧杯，用 0.05mol/L的盐酸或者氢氧化钠分别滴定至 pH=6、pH=7 和 pH=8，备用。取浓度为 0.05mol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 600ml，分置于 3 个烧杯，用 0.05mol/L 氢氧化钠溶液滴定至 pH=8.6、pH=9、pH

7、=10 备用。取浓度为 0.05mol/L 磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液 400ml，分置于两个烧杯，用 0.05mol/L氢氧化钠溶液分别滴定至 pH=11、pH=12，备用。 酶活的测定（NaOH 滴定法） 固体：精密称取固状酶粉 0.500g，放入小烧杯中，用约 50ml 甘氨酸-氢氧化钠溶液溶解， 磁力搅拌 15-20 分钟，转移至 100ml 容量瓶中，用缓冲液多次冲洗烧杯，同时转移到容量 瓶中， （注意不要起泡） ，定容至刻度，振摇 1 分钟左右，静置 20 分钟以上，取上清液再次 进行下一步稀释，稀释倍数：以样品与对照消耗碱量之差在 4.5-5.5ml 范围内。 液体：准确吸取 1

8、ml 样品于 100ml 容量瓶中，用缓冲液定溶到刻度，摇匀，进行下一步稀 释，稀释倍数：以样品与对照品之差在 4.5-5.5ml 范围内。再次稀释不得超过两次。 测定：取 100ml 三角瓶 2 只（此实验由于反应初的 pH 都是经过校正的，所以无对照样） ， 每杯中的组成液为：4.0ml 缓冲液（此缓冲液为以上配制滴定好的缓冲液，测试不同 pH 时 选择不同的缓冲液） ，5.0ml 橄榄油乳化液，1.0ml 酶液。以上除酶液以外的组成液置于 36 摄氏度水浴锅预热 5 分钟，使用前再次校正 pH 使之保持在所测 pH 内（可用滴管滴入少许 盐酸或者氢氧化钠溶液） ，然后精确加入 1ml 酶

9、液，精确计时，缓慢震荡（80 次每分钟） ， 保温 10 分钟，立即加入 95%酒精 20ml，取出，加入 10ml30%氯化钠溶液，摇匀，使之破 乳约 1 分钟，并同时做空白对照，对照同样品一样，先预热 5 分钟，保温 10 分钟，立即加 入 20ml95%酒精（1ml 酶液先加入该 20ml95%酒精灭活） 。 用 0.01mol/NaOH 滴定样品至反应初所调的 pH，反应后的样品应在半小时内完成滴定。 通过稀释倍数和所需的滴定碱液，换算出酶的活性，记录结果，通过对结果的分析得出脂 肪酶的最适反应 pH。 依照以上步骤对缓冲液 pH=4、5、6、7、8、8.6、9、9.5、10、11、1

10、2 各做一次。五、结果数据： 酶的最适 Ph 记录pH反应后的 PH 值所消耗的 0.01mol/L 的 NaOH 溶液酶活性值456788.699.5101112总结脂肪酶的温度耐受性试验 一、目的：检验脂肪酶对不同温度的耐受性 二、原理：脂肪酶液能分解脂肪产生脂肪酸，使反应液的酸度下降，经过温度耐受过程后， 脂肪酶残留活性与所产生的脂肪酸呈正相关性，酶对不同温度的耐受性可以间接体现在久 置于某温度后所残留的活性。对残留活性按国标“脂肪酶的活性测定”即可检验出来。 三、方法：用蒸馏水溶解脂肪酶，置于需检测的温度环境内水浴，每隔一段时间取出一个 样品按国标里“脂肪酶的活性检测”进行检测酶的残留

11、活性。 四、检测过程： 酶的温度耐受过程 精密称取固状酶粉 0.500g，放入小烧杯中，用约 50ml 蒸馏水溶解，磁力搅拌 15-20 分钟， 转移至 100ml 容量瓶中，用蒸馏水次冲洗烧杯，同时转移到容量瓶中， （注意不要起泡） ， 定容至刻度，振摇 1 分钟左右，在 30 摄氏度水浴环境静置，每隔 20 分钟取一次上清液 （六十度以上的每十分钟取一次样） ，检验酶残留活性。至少做到 100 分钟以上或者酶活与 前一次送检值无大的变化。 残留酶活的测定（NaOH 滴定法） 对上一步所取的液体样品，取上清液再次进行下一步稀释，稀释倍数：以样品与对照消耗 碱量之差在 4.5-5.5ml 范围

12、内。 液体：准确吸取 1ml 样品于 100ml 容量瓶中，用缓冲液定溶到刻度，摇匀，进行下一步稀 释，稀释倍数：以样品与对照品之差在 4.5-5.5ml 范围内。再次稀释不得超过两次。 测定：取 100ml 三角瓶 3 只，其中 2 只是试样，1 只是空白对照，每杯中的组成液为： 4.0ml 缓冲液（pH9.4） ，5.0ml 橄榄油乳化液，1.0ml 酶液。以上除酶液以外的组成液置于 36 摄氏度水浴锅预热 5 分钟，然后精确加入 1ml 酶液，精确计时，缓慢震荡（80 次每分 钟） ，保温 10 分钟，立即加入 95%酒精 20ml，取出，加入 10ml30%氯化钠溶液，摇匀，使 之破乳

13、约 1 分钟，并同时做空白对照，对照同样品一样，先预热 5 分钟，保温 10 分钟，立 即加入 20ml95%酒精（1ml 酶液先加入该 20ml95%酒精灭活） 。 用 0.01mol/NaOH 滴定样品至空白溶液的 Ph。反应后的样品应在半小时内完成滴定。 把酶的初溶静置的水浴温度分别改为 40、50、60、70、80、90 摄氏度，重复以上试验。通过稀释倍数和消耗碱液体积，换算出对应酶活性，记录结果。 五、检测数据： 温度耐受性耐受 温度20min 时 酶活性40min 时酶 活性60min 时酶 活性80min 时 酶活性100min 时酶活性120min 时酶活性备注30405060

14、708090总结脂肪酶的 pH 耐受性试验一、目的：检验脂肪酶对不同 pH 的耐受能力 二、原理：脂肪酶能分解脂肪产生脂肪酸，所产生的脂肪酸的含量与特定数量、特定温度 下酶的活性成正相关性，通过对酶在不同酸度下久置后，检测酶的残留活性，即可检测酶 对不同 pH 的耐受性。 三、方法：选择对脂肪酶催化有惰性的缓冲液，利用盐酸或者氢氧化钠滴定至所需的酸度，用此酸度的缓冲溶液替换国标“脂肪酶活性测定”里的脂肪酶初溶解缓冲液，并再次滴定校正 pH 至所需酸度。不同 PH 段选择不同的缓冲液，其中 pH=45 的时候选择0.05mol/L 甘氨酸-盐酸缓冲液（缓冲范围 2.2-5.0），pH=68 的时

15、候选用 0.05mol/L 磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液（缓冲范围 5.8-8.0），pH=8.610 的时候选择 0.05mol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(缓冲范围 8.6-10.6)，pH=1112 的时候选择 0.05mol/L 磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液（缓冲范围 10.9-12.0）。四、检测过程： 温度耐受过程：精密称取固状酶粉 0.500g，放入小烧杯中，用约 50ml 初溶缓冲液（甘氨 酸-盐酸缓冲液用稀盐酸滴定到 pH=4）磁力搅拌 15-20 分钟，转移至 100ml 容量瓶中，用 缓冲液多次冲洗烧杯，同时转移到容量瓶中， （注意不要起泡） ，定容至刻度，振摇 1 分钟 左

16、右，静置 100 分钟， 酶残留活性检测： 取上清液再次进行下一步稀释，稀释倍数：以样品与对照消耗碱量之差在 4.5-5.5ml 范围内。液体：准确吸取 1ml 样品于 100ml 容量瓶中，用缓冲液定溶到刻度，摇匀，进行下一步稀 释，稀释倍数：以样品与对照品之差在 4.5-5.5ml 范围内。再次稀释不得超过两次。 测定：取 100ml 三角瓶 3 只，其中 2 只是试样，1 只是空白对照，每杯中的组成液为： 4.0ml 缓冲液（pH9.4） ，5.0ml 橄榄油乳化液，1.0ml 酶液。以上除酶液以外的组成液置于 36 摄氏度水浴锅预热 5 分钟，然后精确加入 1ml 酶液，精确计时，缓慢震荡（80 次每分 钟） ，保温 10 分钟，立即加入 95%酒精 20ml，取出，加入 10ml30%氯化钠溶液，摇匀，使 之破乳约 1 分钟，并同时做空白对照，对照同样品一样，先预热 5 分钟，保温 10 分钟，立 即加入 20ml95%酒精（1ml 酶液先加入该 20ml95%酒精灭活） 。用 0.01mol/NaOH 滴定样品至空白溶液的 Ph.反应后的样品应在半小时内完成