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1、 J. Lake Sci.(湖泊科学), 2009, 21(3): 369-374 http:/www.jlakes.org. E-mail: 2009 by Journal of Lake Sciences 与微囊藻胞外多糖降解相关的微生物菌群分析 蔡元锋1,2, 施丽梅1, 李朋富1,2*, 邢 鹏2, 于 洋2, 孔繁翔2 (1: 南京大学生命科学学院, 南京 210093) (2: 中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室, 南京 210008) 摘 要: 从铜绿微囊藻培养液中提取胞外多糖, 化学分析显示其为含 8.3%蛋白质的酸性杂多糖. 以胞外多糖为碳源接种自然水体
2、的菌群进行富集培养, 分析胞外多糖的微生物降解过程及降解菌的组成. 结果表明, 接种太湖水华期微生物富集菌群后, 多糖立即开始被降解, 大约在 18d 后多糖降解过程显著减慢, 37d 后仍有一部分多糖未能被降解. 这些结果说明在自然界中微囊藻胞外多糖是可以被微生物降解的. 比较不同水体的菌群对多糖的降解能力后显示, 降解菌群只存在于微囊藻水华暴发的阶段. 变性梯度凝胶电泳(DGGE)结果显示在整个降解过程中, 降解菌群的组成未发生显著变化. 对 DGGE 条带中的 DNA 片段进行序列分析和系统发育分析表明降解菌群包含以下几类: 鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)3 个, 褐螺菌属(
3、Phaeospirillum)1 个, 假单胞菌属(Pseudomonas)1 个, 红环菌科(Rhodocyclaceae)1 个, Hylemonella(无译名)1 个, 分枝杆菌属(Mycobacterium)1 个. 关键词: 微囊藻; 胞外多糖; 降解; 变性梯度凝胶电泳; 菌群 Composition of bacterial community related to degrading the exopolysaccharide from the cyanobacterium Microcystis aeruginosa CAI Yuanfeng1,2, SHI Limei1,
4、 LI Pengfu1,2, XING Peng2, YU Yang2 exopolysaccharide; microbial degradation; DGGE; bacterial community * 江苏省自然科学基金(BK2007150)、 国家重点基础研究发展计划(2008CB418004)和中国科学院王宽诚博士后工作奖励基金联合资助. 2008-08-10 收稿; 2008-09-18 收修改稿. 蔡元锋, 男, 1983 年生, 硕士研究生; E-mail: . * 通讯作者; E-mail: . J. Lake Sci.(湖泊科学), 2009, 21(3) 370 由于
5、水体富营养化而导致的蓝藻水华在世界范围内频繁发生, 微囊藻(Microcystis spp.)是形成蓝藻水华的主要种类之一, 在我国尤为常见. 微囊藻胞外多糖为酸性杂多糖, 能够富集金属离子, 影响水体中金属离子的溶解、沉积、生物利用和循环; 胞外多糖将微囊藻细胞包裹在一起形成群体, 可以阻止一些浮游动物的吞食, 保持其在水体中的生存竞争优势, 并可使水华持续较长的时间; 一部分微囊藻胞外多糖溶解到周围水体中, 不仅影响到水体中多糖的浓度, 还可以与微生物和碎屑粘结形成有机颗粒(organic aggregates)1-2, 使水体浑浊度增加. 在英国的1个湖泊中调查发现, 水华发生时包裹着微
6、囊藻群体的胞外多糖可以占水体变温层(epilimnion)体积的0.007%, 在水华高峰期可以占到0.06%3. 作为水体中异养微生物生长的重要营养源, 藻类胞外多糖影响水体中微生物的丰度和多样性4. 水华暴发过程中湖泊水体中长时间地存在大量的微囊藻胞外多糖, 微囊藻胞外多糖的微生物降解过程是湖泊碳循环的重要环节. 本文旨在研究微囊藻胞外多糖的微生物降解过程和降解菌群的组成, 为探讨蓝藻水华的暴发规律及蓝藻水华的防治提供新的基础信息. 1 材料与方法 1.1 微囊藻的培养及其胞外多糖的提取 铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa FACHB-912)购自中国科学院水生生物研
7、究所, 该藻株由雷腊梅在 1997 年分离自太湖. 2L 藻液培养在 3L 锥形瓶中, 培养基为 BG11, 培养过程中通入过滤空气, 光强2000lx, 光暗比 12h:12h, 温度 25. 培养 30d 的藻液 6000r/min 离心 10min, 收集上清液, 上清液依次用0.8m、0.45m 和 0.22m 的微孔滤膜抽滤, 滤液用蒸馏水透析(透析袋截留分子量 7000Dalton)72h, 45减压浓缩后, 部分作为铜绿微囊藻胞外多糖(MEPS)母液用于微生物降解和化学组成分析, 部分冻干用于化学组成分析. 1.2 MEPS 的化学组成分析 1.2.1 中性单糖组成分析 称取冻干
8、 MEPS样品 10mg 放入安瓿瓶中, 加入 2mol/L三氟乙酸 1.5ml, 充入氮气, 烧融封口, 在 120下水解 3h, 水解后的糖溶液用过滤空气吹干后, 按照李铁林等的方法进行糖腈衍生化5. 具体方法如下: 加入 10mg 盐酸羟胺和 0.5ml 吡啶, 90水浴 30min 并振荡, 取出后冷至室温, 加入0.5ml醋酸酐, 在90下继续反应30min进行乙酰化, 反应完成后进行气相色谱分析. 单糖标准品处理同上. 气相色谱条件: 仪器为HP-6890气相色谱仪, 色谱柱为HP-55%苯甲基硅烷(30m0.25mm0.25m); 流量1.2ml/min; 进样温度260; 程序
9、升温: 146保留2min, 从146以2/min升温到210, 从210以30/min升温到280; FID检测器, 检测温度300, 载气为氮气; 进样量1l. 1.2.2 糖醛酸定性和定量分析 糖醛酸定性分析: MEPS 的水解方法同上, 干燥后的水解产物加入 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP, 0.5mol/L 甲醇溶液)20l 和 20l 0.3mol/L 氢氧化钠溶液, 70水浴反应 30min, 衍生产物加入 30l 0.3mol/L 盐酸溶液中和. 为了去除多余的试剂, 衍生产物使用氯仿萃取 2 次, 最终得到的水相产物用于 HPLC 分析. 糖醛酸标准品处理同上. H
10、PLC 条件: 色谱柱: ZORBAX SB-C18(150mm4.6mm); 流动相: 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液-乙腈(V:V=83:17); 流速: 0.7ml/min; 柱温: 30; 检测波长: 245nm. 糖醛酸定量分析采用咔唑-硫酸法分析6. 于带塞试管中加入 0.8ml MEPS 溶液, 然后向试管中分别加入 4mol/L 氨基磺酸和 pH8.4 的硼酸缓冲液各 0.1ml, 混匀后再加入 96.4%的浓硫酸 5ml, 于 100水浴锅中水浴 6.5min, 冷却后加 0.2ml 0.2%咔唑乙醇溶液混匀, 100水浴锅中水浴 10min, 冷却后于 525nm测 OD
11、值, 以葡萄糖醛酸为标准品绘制标准曲线, 由标准曲线计算出糖醛酸含量. 1.2.3 蛋白质和金属元素含量分析 采用南京建成生物工程研究所的考马斯亮兰法蛋白测定试剂盒测定蛋白含量. 用 ICPS-1000型电感耦合等离子体发射光谱仪(日本岛津公司产品)分析金属元素的含量. 1.3 MEPS 降解过程分析 接种所用的微生物水样分别在 2007 年 8 月、12 月即微囊藻水华期和无水华期取自太湖梅梁湾, 8 月蔡元锋等: 与微囊藻胞外多糖降解相关的微生物菌群分析 371还在南京市浦口区一个鱼塘采集了微生物水样, 该鱼塘 10 多年无蓝藻水华发生, 所采样品作为无水华水体水样. 2008 年 5 月
12、再次在太湖梅梁湾采集了水华期微生物水样. 水样取回后立即用无菌 Whatman GF/F膜过滤以除去原生动物、 藻类和其他颗粒物质. 5ml 滤液接种到 100ml 培养基(成分为: 50ml 含 BG11 培养基各成分的浓度约230mg/L的MEPS+50ml无菌太湖水)中, 25条件下暗处进行富集培养, 每天定期摇动, 每 15-20d 后转接到 10 倍体积的新鲜培养基中. 将稳定的富集培养菌液接种于同样的培养基, 在相同的培养条件下进行降解过程分析. 降解过程中总碳水化合物的含量变化分析: 取 1ml 培养液样品, 8000r/min 离心 15min, 上清用苯酚-硫酸法7检测碳水化
13、合物的量. 降解菌生物量的变化分析: 取 1ml 菌液用 2%甲醛固定, DAPI 染色后用荧光显微镜计数8. 所有降解实验均重复 3 次. 1.4 PCR-DGGE 分析降解菌组成 在分析MEPS降解过程中定期取1ml菌液, 离心后将细菌保存于-20. 降解菌基因组的提取参照文献 9, 采 用 对 大 多 数 细 菌 和 古 生 菌 16S rDNA 基 因 V3-V5 区 具 有 特 异 性 的 引 物 对341F(5-CCTACGGGAGGCAGCAG)和907R(5-CCGTCAATTCA/CTTTGAGTTT)对提取的样品基因组进行 PCR 扩 增 , 其 中 引 物 341F 的
14、5 端 连 接 着 40 个 碱 基 的 GC 发 夹 结 构 (5-CGCCCGCCGCGCG CGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGC). 采用Touchdown反应策略, 条件如下: 95预变性5min, 以下为94 1min, 65-56 30s(每个循环降1, 共10个循环), 72 1min, 后20个循环用55退火, 最后72下延伸30min10. 变性梯度凝胶电泳(DGGE)条件为: 聚丙烯酰胺凝胶浓度6%, 变性梯度40%-70%(100%变性剂为7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺的混合物), 电泳缓冲液为1TAE, 60条件下100V电泳16-18h. 聚丙
15、烯酰胺凝胶用SYBR Green (用TAE稀释10000倍)染色30min后, 用Omega 10TM全自动多功能凝胶成像分析系统拍照. 1.5 降解菌的系统发育分析 从聚丙烯酰胺凝胶上切下条带, 放到1.5ml离心管中捣碎, 加入TE缓冲液30l, 4过夜使DNA溶出.取离心后上清为模板, 用上述同样的引物(其中341F不含GC夹)和程序扩增, PCR产物送上海生工生物工程技术有限公司测序11. 将测得的16S rDNA序列在GenBank数据库中进行相似性比较, 选取同源性较高的相关菌株16S rDNA序列作为参比对象, 用Clustal W进行多重序列比对, 然后采用MEGA 4.0软
16、件中的邻接法构建系统发育树12. 测序结果同时提交到GenBank获得序列号为EU887518到EU887526. 2 实验结果 2.1 化学组成分析 MEPS含鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖5种中性单糖, 摩尔比为7.4:6.6:1.4:1.0:1.0. 含葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸两种酸性单糖, 糖醛酸含量为6.7%, 蛋白质含量为8.3%, 等离子光谱分析结果显示, MEPS含多种金属元素, 其中Ca和Mg含量较高(表1). 表 1 MEPS 金属元素含量(mg/g) Tab.1 Metal content of MEPS 金属元素 Al Ba Ca Cu Fe Mg Mn Na Sr Zn 元素含量 0.130 0.023 44.1420.144 0.098 10.0370.059 0.67
