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1、凉血化瘀方治疗湿性老年性黄斑变性回顾性临床研究及作用机制探讨中文摘要【目的】1 总结分析凉血化瘀方加减对渗出性年龄相关性黄斑变性( a g er e1a t edm a c u1a rd e g e n e r a tio n ，A M D ) 的治疗作用及远期效果。2 探讨凉血化瘀方成药( 明睛颗粒) 对实验性脉络膜新生血管( Ch o r oid a ln e o v a s c ula riz a tio r l ，C N V ) 的疗效观察及作用机制。【方法】1 回顾性总结分析2 0 0 5 年1 月一2 01O 年4 月到唐由之研究员门诊就诊且至少一只眼诊断为渗出性A M D 的单纯
2、服用凉血化瘀加减方全部患者，设定纳入、排除标准，对初诊及治疗后1 个月、3个月、6 个月、12 个月患者视力、眼底情况、O C T 分别评价分析。2 采用视网膜下注射M a t r ig e l 的方法建立实验性C N V 模型，通过眼底彩照、F F A 、脉络膜铺片、组织病理改变分别进行评价分析，确定M a t rig el 最佳浓度及操作方法。3 将4 0 只青紫蓝兔随机分为空白对照组、模型组、明睛颗粒高、中、低剂量组，视网膜下注射M a t rig el后连续观察2 8 天，通过眼底彩照、F F A 、组织切片对治疗效果进行评价；通过免疫组织化学检测C D14 和C D 2 0 6 阳性
3、细胞在玻璃体、视网膜及脉络膜的表达情况。4 以S P F 级7 0 只C 5 7 B L 6 小鼠作为研究对象，以激光诱导C N V 形成作为模型建立方法，采用冰冻组织切片及免疫荧光双标技术观察新生血管在激光斑处的增生情况、V E G F的表达以及巨噬细胞的分布及表型分析，观察明睛颗粒对上述指标的影响作用。【结果】1 接受凉血化瘀方加减治疗渗出性A M D 的患者1 个月后视力即有显著性提高( p O 0 5 ；6 个月时复诊者4 7 人65 只眼，视力0 2 2 2 ，平均0 8 5 ，视力提高1 1 只眼，下降10 只眼，稳定4 4 只眼，与初诊自身前后对照，p O 0 5 ；12 个月时
4、复诊者4 5 人5 2 只眼，视力0 2 22 ，平均0 8 3 ，视力提高8 只眼，下降10 只眼，稳定3 4 只眼，与初诊自身前后对照，p O 0 5 ( 表1 ) 。表1 凉血化瘀方加减对渗出性A M D 患者视力的影响木。j 训诊时自身前届对照，P 0 0 5 ，说明患者的视力没有变化，一直保持稳定。3 4 眼底变化的疗效评价第1 个月复诊时大部分患者没有拍摄眼底彩照，故此时间点眼底变化未评价。3 个月时痊愈者3 7 3 5 ，好转占4 6 9 9 ，恶化者占1 2 0 ，其它为不变：6 个月时痊愈者3 3 3 3 ，好转占5 7 14 ，其它为不变；12 个月时统计痊愈者占3 0 7
5、7 ，好转占6 3 4 6 ，其余为不变( 图1 ) 。3 5O C T 的结果评价4 5 只眼具有两次以上O C T 检查结果，对不同时间点视网膜厚度及黄斑容积进行对比，发现除治疗3 个月视网膜厚度较初诊时明显降低外，其它均无统计学差异( 表2 ) 。表2 凉眦化瘀方加减对渗性A M D 患者O C T 结果的影l 响木。j 初诊时自身前后对照，P 0 0 5l6凉血化瘀方治疗湿性老午陛黄斑变性回顾性临床研究及作用机制探讨3 6 典型病例3 6 1 病例一，张某，女，6 3 岁，主因右眼视力下降l4 年，加重2月就诊。l4 年前当地医院诊断“右眼湿性黄斑变性”，予中药治疗，此后右眼反复出血两
6、次。患者来我院唐老门诊就诊后，采用凉血化瘀方连续治疗8 个月，近视力略有提高，眼底出血完全吸收，F F A 检查荧光渗漏面积明显减小，O C T 显示视网膜层间水肿基本消失、新生血管团趋于瘢痕化( 详见表3 ，图2 、3 ) 。表3 凉血化瘀方加减对病例一患者右跟视力的影响3 6 3 病例二，余某，女，6 6 岁，主因双眼视力下降2 年、左眼加重1 年就诊，当地医院诊断为“左眼黄斑出血”，予中药治疗，视力无明显改善。遂来唐老门诊就诊，诊断为“双眼A M D ( 左眼湿性，右眼干性) ”，予中药加减凉血化瘀方治疗。治疗后左眼视力显著性提高，眼底情况稳定，O C T 显示新生血管团明显缩小。患者停
7、药后2 年因左眼视力下降三天再次就诊，查眼底左眼黄斑区可见新的出血( 约3 P D ) 及渗出，经治疗出血面积明显缩小( 详见表5 ，图4 、5 ) 。表5 凉J 1 【化瘀方加减对病例二患者左眼视力的影响l7中国中医科学院2 0 12 年申请临床医学博士专业学位论文4 讨论本课题对唐老多年治疗渗出性A M D 的门诊患者进行回顾性病例分析，发现凉血化瘀方加减治疗本病从1 个月开始视力有显著性提高，连续治疗3 个月视力提高大于两行者占l6 13 ，眼底出血及渗出的情况在8 4 3 4 患者中有好转乃至痊愈，平均视网膜厚度在3 个月时也有明显减少。综合分析来看，凉血化瘀方提高视力的主要原因在于能
8、快速有效地减少视网膜出血、渗出及水肿的情况，从而在一定程度上改善视力。而随着观察时间延长，发现眼底变化情况要好于视力提高情况，即6 个月时眼底好转加痊愈者占9 0 4 7 ，视力稳定加提高者占7 8 4 6 ；12 个月时眼底好转加痊愈者占9 4 23 ，视力稳定加提高者占7 8 7 6 ，一方面是由于眼底出血情况可以再次出现，但服用凉血化瘀方之后新的出血和渗出又能很快得到吸收；另外是因为患者病程较长时即使眼底出血、渗出得到改善，但视网膜各层细胞的功能已经难以恢复；第三是由于本病均发生在中老年患者，相当一部分患者都合并有或开始出现轻中度白内障，白内障本身的自然进程也是影响视力的一个因素。尽管如
9、此，服用凉血化瘀方后患者的眼底、视力及O C T 表现可以在一定时间保持稳定( 此次观察最长为1 年) 。而从渗出性A M D 自然进程来看，在同样的观察时间内( 1 年) ，仅有5 的患者E D T R S 视力表检查可提高至少15 个字母，6 2 患者视力下降不大于15 个字母。与其它治疗相比，单纯使用雷珠单抗注射液( 抗V E G F 抗体) 玻璃体腔注射，9 5 的患者视力下降不大于15 个E D T R S 视力表字母( 三行) ，3 4 的患者视力可提高至少15 个字母，而这种治疗方法可引起1 的眼内炎和1 的严重葡萄膜炎n 卜2 。尽管在疗效评判时，因视力表不同结果分析有一定差异
10、，但凉血化瘀方加减治疗渗出性A M D 临床疗效还是十分肯定的。尽管如此，从整体治疗过程来看，凉血化瘀方尚不能从根本上完全抑制C N V 生长，不能完全使之消失或瘢痕化，因此选择合适的治疗时机联合应用P D T 及眼内注射抗V E G F 药物将会取得更好的临床疗效。眼底有大面积新鲜或陈旧性出血会在一定程度上影响P D T 治疗，凉血化瘀方治疗湿性老年性黄斑变性回顾性临床研究及作用机制探讨而凉血化瘀方的促进出血、渗出作用十分明显，因此，从本次病例回顾性分析的结果来看，处于病变活动期的患者首先选择服用卜3个月的中药后再接受其它西医治疗措施将会使两种治疗手段都能最好的发挥出来，取得更好的临床疗效。
11、此外，本次病例总结发现由于一部分老年患者合并有轻中度白内障，因此眼底彩照并不能很全面的反应病变情况，一定要结合当时的病例书写记录进行评价分析。由于患者不是每个时间点都来复诊，因此在统计每个时间点的复诊记录时相当一部分患者的检查不完整，这也在一定程度上缩小了样本含量。因此，我们期望在不久的将来，多中心、大样本随机双盲对照的临床研究对凉血化瘀方治疗湿性A M D 进行更客观、全面的评价，为本治疗方法的推广应用提供更有力的证据支持。中国中医科学院2 0 12 年申请临床医学博士专业学位论文第一部分附图C圜图l 凉血化瘀方加减 对渗出性A M D 患者眼底变化的影响图2 凉血化瘀方加减对典型病例。患者
12、眼底情 况的影响A 初诊时眼底黄斑区 可见黄白色渗出周围新鲜出血环绕：B 治疗 3 个月后眼底出血大部分吸收：C 治疗6 个月后眼底出血完全吸收，黄斑区病灶 瘢痕化：D 治疗 后12 个月随诊眼底情况稳定。图3 典型病例一患者O C T 经凉血化瘀方加减治疗的变化A 初诊时眼底O C T 示视阳膜层问水肿、R P E ) 2 - 脱离：B 治疗3 个月后税嘲膜层f 司水肿 i j j 显 减轻R P E 脱离减轻：C 治疗6 个月后视网膜无明显水肿，R P E 层平复：D 治凉血化瘀方治疗湿性老年性黄斑变性回顾性临床研究及作用机制探讨疗后l2 个月随诊视网膜各层情况稳定。图4 典型病例二患者O
13、 C T 治疗前后变 化A 初诊时视网膜下团状强反射：B治疗3 个月后团状强反射厚度及范围较 初诊变薄及缩小；C 治疗6 个月后与初诊时相比团状强反射变薄，层问隙增厚。图5 典型病例i 患苦治疗前后眼底变化A D 分别为患者初诊、治疗2 个月、6 个月、12 个月时眼底，表现为黄斑区黄白色病灶，一商稳定：E 患者自行 停药2 年后眼底出现新的出血及渗出：F 治疗1 个半月后眼底出血大部分吸中国中医科学院2 0 1 2 年申请临床医学博士专业学位论丈凉血化瘀方治疗湿性老年性黄斑变性回顾性临床研究及作用机制探讨第二部分M a t rig el 诱导实验性脉络膜新生血管的模型研究1 前言脉络膜新生血
14、管( C h o r oid a ln e o v a s c ula riz a tio n ，C N V ) 是眼科多种疾病的临床病理特征，常见于年龄相关性黄斑变性、眼组织胞浆菌病综合征、病理性近视、多灶性脉络膜炎以及血管样条纹等。尤其在湿性A M D 的发病中，C N V 的出现会带来眼底视网膜下出血、渗出及纤维组织增生，严重而急速地导致患者中心视力下降。如何对C N V 进行治疗已经成为这类疾病的主要治疗目标，目前的治疗手段主要有药物、基因治疗、手术及光动力疗法等。而在对治疗方法的研究开发过程中，一个合适的动物模型显得尤为重要。目前围绕C N V生成的动物模型存在很多问题：如重复性差、
15、成功率不高、C N V 生长不持久等。例如目前应用最广泛的是激光打破B r u C h S 膜诱导C N V形成，可应用于灵长类动物、大鼠、小鼠等，缺点是在兔眼上造模不满意，而兔眼较大，比小鼠更适合于眼局部给药的疗效观察；此外在这个模型上C N V 活动期时问短，局部瘢痕化现象出现早。M a t rig el 是一种由E n g e1b r e th H ol m S w a r m ( E H S ) 小鼠肉瘤中提取的基质胶，主要含有层粘连蛋白、胶原蛋白I 、肝磷脂蛋白多糖以及一些生长因子如b F G F 、IG F 、E G F 等。M a t rig e1 的物理特性是在4时为液态，3
16、7 时为固态，固态时能够缓慢释放各种生长因子。以往实验正是利用这种生物物理学特点将M a t r ig e1 注入视网膜下，在局部形成类似于d r us e n 的组织结构，诱导C N V 生成27 - 2 8 1 。本实验在既往实验研究基础上，结合本实验室研究条件和手段，试图探讨不同剂量M a trig el 注入青紫蓝兔视网膜下后眼后节组织的变化及C N V 生长情况，为此模型的进一步应用奠定基础。2 材料和方法2 1 实验对象健康青紫蓝兔，体重2 2 5 k g ，雌雄不限，经裂隙灯、眼底镜检查无中国中医科学院2 0 1 2 年中请临床医学博士专业学位论文先天眼疾者可纳入实验。实验动物购自北京芳元缘养殖场。2 2 主要实验试剂及配制M a trig e1 ，美国B D 公司，编号3 5 6 23 4盐酸赛拉嗪注射液，吉林省华牧动物保健品有限公司，批号2 010 6盐酸氯胺酮注射液，福建古田药业有限公司，批号10 0
