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1、基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶 MMP-MMP- 2 2、MMP-9MMP-9 及其组织抑及其组织抑 制剂制剂 TIMP-1TIMP-1、TIMP-2TIMP-2 与滋养细胞疾病关系与滋养细胞疾病关系 的研究的研究作者：步仰高,张洪福,胡勇,朱贝利,王永珍单位：安徽医科大学病理教研室(张洪福) 230031 合肥 解放军 105 医院病理科(胡勇)【摘要】 目的 通过研究基质金属蛋白酶 MMP-2、MMP-9 及其组织抑制剂 TIMP-1、TIMP-2 在不同类型滋养细胞疾病中的表达，探讨基质金属蛋白酶系统与滋养细胞及滋养细胞疾病的关系。 方法 应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织化学方法
2、对 20 例正常早孕(12 周)绒毛组织、15 例部分性葡萄胎、55 例完全性葡萄胎、15 例侵蚀性葡萄胎、8 例绒毛膜癌组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 进行检测。 结果 (1)MMP-2 在不同类型滋养细胞中的表达差异无统计学意义(2=0.926，P=0.921);(2)MMP-9 在正常早孕绒毛组织、部分性葡萄胎、完全性葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌中均100%表达，但随着滋养细胞恶性程度的增加其表达显著升高，差异有统计学意义(2=26.421，P=0.0001);(3)TIMP-1 在正常早孕绒毛组织均有表达，而在部分性葡萄胎、完全性葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜
3、癌中分别有6.67%、5.45%、6.67%、12.50%不表达，且随着肿瘤恶性程度的升高，其染色程度和染色细胞百分率减少，差异有统计学意义(2=9.575，P=0.048);(4)TIMP-2 在各组织中的表达差异无统计学意义(2=1.462，P=0.833)。 结论 随着滋养细胞疾病恶性程度的增加,MMP-9 表达上调而 TIMP-1 表达下调。MMP-2、TIMP-2 与滋养细胞浸润无密切关系。 【关键词】 金属蛋白酶类;金属蛋白酶组织抑制因子;妊娠;滋养细胞疾病;免疫组织化学Matrix metalloproteinases and its tissue inhibitors in g
4、estational trophoblastic Bu Yanggao, Zhang Hongfu, Hu Yong, et al The Department of Obstetrics and Gynecology 105th Hostpital PLA, Hefei 230031Abstract Objective To study the expression of matrix metallopreteinases (MMP-2,9) and tissue inhibitors of metallopreteinases (TIMP-1,2) in human gestational
5、 trophoblastic disease and their correlation with clinic pathological parameters in predicting the malignant transformation and metastasis. Methods Immunohistochemical streptavidin-peroxidase (S-P) method was used to detect the expression of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 in 20 cases of normal human c
6、ytotrophoblast cells,15 cases of partial hydatidiform moles, 55 cases of complete hydatidiform moles, 15 cases of invasive moles and 8 cases of choriocarcinoma. Resealts (1) No significant difference with MMP-2 expression in all cases(2=0.926，P=0.921).(2) MMP-9 expression was detected in all types o
7、f trophoblastic cells, the staining was markedly increased with the development of the malignant transformation(2=26.421，P=0.0001).(3) Each cases of normal human cytotrophoblast cells expressed TIMP-1, but 6.67% of partial hydatidiform moles, 5.45% of complete hydatidiform moles, 6.67% of invasive m
8、oles and 12.50% of choriocarcinoma had no TIMP-1 expression, the staining was decreased with the development of the malignant transformation(2=9.575，P=0.048). (4) The expression of TIMP-2 in all cases has no significant difference(2=1.462，P=0.833). Conclusion Upregulation of the MMP-9 and downregula
9、tion of the TIMP-1 are related to the malignancy degree in the trophoblastic disease. MMP-2 and TIMP-2 might have no closely related to the invision of trophoblast.Key words Metalloproteinases; Tissue inhibitor of metalloproteinases; Pregnancy; Gestational trophoblastic disease; Immunohistochemistry
10、滋养细胞类似于肿瘤细胞，有增殖、分化、侵袭能力，其侵袭过程是通过粘附、穿越、降解细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)而完成。但滋养层细胞又不同于肿瘤细胞，其侵袭行为受严格的时空调控，早孕期侵袭能力强，晚孕期则降低甚至消失;滋养细胞侵入仅限于蜕膜和近 1/3 子宫肌层1。滋养细胞的侵袭能力受子宫旁分泌和滋养层细胞自分泌的多种因子介导进行精细调节，其中基质金属蛋白酶系统对 ECM 的降解是滋养层细胞侵袭的限速步骤，在滋养细胞的生理和病理过程中起着重要作用2。本研究旨在通过运用免疫组织化学方法检测 MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 在不同滋养细胞中的表达，
11、探讨基质金属蛋白酶系统与滋养细胞关系，了解基质金属蛋白酶系统在滋养细胞侵袭、胎盘形成等过程中的作用，并试图寻求可以预测滋养细胞疾病恶变和滋养细胞肿瘤转移潜能的指标，为临床早期预测滋养细胞疾病的恶变及预防性化疗提供可靠依据。1 材料与方法1.1 标本来源 收集安徽医科大学及解放军 105 医院妇产科滋养细胞疾病病例进行分析研究，整理其存档组织蜡块。患者诊断标准、组织学分型标准按照妇产科学(第 6 版)。包括20 例正常早孕(12 周)绒毛组织、15 例部分性葡萄胎、55例完全性葡萄胎、15 例侵蚀性葡萄胎、8 例绒毛膜癌。相关病例均综合采用 HCG-RIA、盆腔 B 超、X 线胸片等辅助检查进行
12、随访。1.2 实验试剂 (1)即用型鼠抗人 MMP-9 单克隆抗体，克隆号 GE-213。(2)即用型鼠抗人 TIMP-1 单克隆抗体，克隆号102D1。(3)即用型免疫组织化学超敏 UltosensitiveTMS-P(鼠/兔)试剂盒，包括：内源性过氧化酶阻断剂、正常动物非免疫血清、生物素标记的第二抗体、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶等。以上试剂均由美国 Maxim Biotech 公司生产，购自福州迈新生物技术有限公司。1.3 实验方法 (1)组织标本收集及处理：全部标本均在手术时收集，采用常规病理学固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等一系列处理。(2)采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(S
13、P)免疫组织化学方法检测标本中 MMP-9、TIMP-1 的表达情况。实验步骤按试剂说明书进行。(3)用已知阳性片作为阳性对照，用 PBS 代替第一抗体作为阴性对照。1.4 结果判断标准 (1)观察阳性反应采用双盲法，并由两位有经验的病理科医师独立观察每张切片后一起做出判断。(2)用低倍镜和高倍镜观察切片，每张切片观察 5 个高倍视野，每个视野计数 100 个细胞，取平均值。阳性细胞为镜下组织结构清晰，细胞质内有棕黄色颗粒沉着，染色明显高于背景。根据以下标准将染色细胞数量分为 4 级：0 级：即阴性，细胞内无棕黄色颗粒出现;(+)级：即弱阳性，少于 10%的细胞内出现较浅的阳性染色，但明显高于
14、阴性对照，个别细胞可中至强阳性;(+)级：即中度阳性，介于弱阳性和强阳性标准之间;(+)级：即强阳性，60%以上细胞中至强阳性染色，少数细胞可为弱阳性染色。1.5 统计学方法 所有实验数据采用 SPSS10.0 软件进行统计分析，相关性采用等级相关系数分析，当 P0.05 时表明差异有统计学意义。2 结果2.1 MMP-2 在不同类型滋养细胞中的表达 MMP-2 在 95.00%的正常早孕绒毛组织、93.33%的部分性葡萄胎、94.55%的完全性葡萄胎中有表达，而在侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌中则 100%表达，且阳性表达多集中在(+)(+)级。MMP-2 在不同类型滋养细胞中的表达差异无统计学意义
15、(2=0.926，P =0.921)。见表 1、图 1。2.2 MMP-9 在不同类型滋养细胞中的表达 MMP-9 在正常早孕绒毛组织、部分性葡萄胎、完全性葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌中均 100%表达，但随着滋养细胞恶性程度的增加其染色阳性细胞数及染色强度增加，提示 MMP-9 表达显著升高，经统计学处理差异有统计学意义(2=26.421，P=0.0001)。见表 2、图 2。2.3 TIMP-1 在不同类型滋养细胞中的表达 TIMP-1 在正常早孕绒毛组织均有表达，而在部分性葡萄胎、完全性葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌中分别有6.67%、5.45%、6.67%、12.50%不表达，且随着
16、肿瘤恶性程度的升高，其染色程度和染色细胞百分率减少，提示 TIMP-1 表达逐渐减少，经统计学处理差异有统计学意义(2=9.575， P=0.048)。见表 3、图 3。2.4 TIMP-2 在不同类型滋养细胞中的表达 TIMP-2 在正常早孕绒毛组织、部分性葡萄胎、完全性葡萄胎、侵蚀性葡萄胎中均有表达，但在绒毛膜癌中有 12.50%不表达，且其染色程度及染色细胞百分率趋向于(+)、(+)级。经统计学处理，TIMP-2在各组织中的表达差异无统计学意义(2=1.462，P=0.833)。见表 4、图 4。3 讨论3.1 MMPs、TIMPs 在正常早孕滋养细胞中的表达及其调控 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一组能降解细胞外基质的高度保守蛋白水解酶3，通过降解 ECM 和基底膜屏障，调节粘附，酶解某些蛋白使其显示潜在活性，激活别的 MMPs 形成瀑布效应等方式参与体内多种生理和病理过程，特别是肿瘤侵袭和转移。MMP-2 是所有 MMPs 中分布最广的，以无活性酶原的形式由多种细胞分泌，
