血红蛋白的提取与分离!2014.10.22

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1、 ( (一一) )蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理一一. .基础知识基础知识根据蛋白质各种特性的差异： 分子的形状、大小 电荷性质和多少 溶解度 吸附性质 对其他分子亲和力 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNADNA，用人和哺，用人和哺 乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么 ？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA， 便于进行便于进行DNADNA的提取，人的红细胞无细胞的提取，人的红细胞无细胞 核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提 取血红蛋白取血红蛋白（二）蛋白质提取和分

2、离的方法凝胶色谱法：又称分配色谱法电泳法1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法2 2）材料：凝胶）材料：凝胶( (分配色谱法分配色谱法) )1 1）概念）概念根据根据相对分子质量的大小分离蛋白质相对分子质量的大小分离蛋白质的的 有效方法有效方法凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖 或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量 较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢; 而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移

3、动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 依据的特性是：依据的特性是：蛋白质相对分子质量大小。蛋白质相对分子质量大小。分子量大小直径大小大于凝胶颗粒空 隙直径，被阻挡 在颗粒的外面小于凝胶颗粒空 隙直径，可以进 入颗粒内部运动方式垂直向下移动垂直向下移动， 无规则扩散进入 颗粒内部 运动速度较快较慢 运动路径较短较长洗脱次序先从凝胶柱洗脱 出来后从凝胶柱洗脱 出来一、基础知识-蛋白质分离和提取蛋白质分离和提取 的原理的原理3. 3.凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理分子筛效应分子筛效应大分子大分子通过多孔凝胶颗粒的通过多孔凝胶颗粒的间隙间隙，路程，路程短短，流动，流

4、动快快；小分子小分子穿过多孔凝胶颗粒的穿过多孔凝胶颗粒的内部内部，路程，路程长长，流动，流动慢慢。凝胶色谱柱洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲 液，促使蛋白质分子的差速流动。 2.2.电泳电泳1)1)概念概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2)2)原理原理利用了待分离样品中各分子带电性质的 差异以及分子本身的大小、形状的不同， 使带电分子产生不同的迁移速度，从而实 现样品中各种分子的分离。3)3)类型类型: : 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳 4)4)实例：实例：SDSSDS聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳用途用途: :

5、测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量鉴定蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度原理：原理： SDSSDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDSSDS复复 合物，合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋所带负电荷的量大大超过了蛋 白质白质分子原有电荷量。使电泳分子原有电荷量。使电泳迁移速率完迁移速率完 全取决于分子的大小。全取决于分子的大小。讨论：如何测定蛋白质的分子量？讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋 白质的分子量时，可选用白质的分子量时，可选用一组已知分子量的一组已知分子量的 标准蛋白同时进行电泳标准蛋白同时进行电泳

6、，根据已知分子量的，根据已知分子量的 标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和 分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋 白质的分子量。白质的分子量。( (三三) )缓冲溶液缓冲溶液抵制外界的酸或碱对溶液抵制外界的酸或碱对溶液pHpH值的影响值的影响 ，维持，维持pHpH基本不变（维持溶液酸碱度稳定基本不变（维持溶液酸碱度稳定 ）。）。1.1.作用作用2.2.配制配制如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4说出人体血液中缓冲液说出人体血液中缓冲液? ?通常由12种缓冲剂溶解于水中配 制而成。调节缓冲剂的使

7、用比例就可以 制得在不同PH范围内使用的缓冲液。电泳检测PCR结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳血血 液液血浆血浆水水 分分其他物质：其他物质：血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细胞胞白细胞白细胞 血小板血小板 红细胞红细胞 （最多）（最多）血红蛋白血红蛋白 （9090）两个两个肽链肽链 两个两个一肽链一肽链 四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团血液有哪些成分？血液有哪些成分？练习巩固 1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白 质的研究和应用越来越深入，首先要做 的一步是 A 弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程 D 获得高

8、纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中， 关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于 相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于 相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于 相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不 同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是 A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长 D 防止血液凝固5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数 和CO2分

9、子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后 分层顺序自上而下是：有机溶剂-脂类物质-血红蛋白溶液-红细胞破碎物沉淀 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量 大的蛋白质 A路程较长，移动速度较慢 B 路程较长，移动速度较快 C路程较短，移动速度较慢 D 路程较短，移动速度较快D 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中 的进行过程可表示为图中哪一个B使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋 白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异二二. .实验操作实验操作(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤 (2)(2)

10、血红蛋白的释放血红蛋白的释放 (3)(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定透析透析除去分子较小的杂质除去分子较小的杂质通过通过凝胶色谱法凝胶色谱法将分子量将分子量 较大的杂质蛋白质除去较大的杂质蛋白质除去通过通过聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定血红蛋白纯度鉴定血红蛋白纯度二、实验操作二、实验操作（一）（一）. .样品处理样品处理 ：本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNA，用哺乳动物的，用哺乳动物的红细胞红细胞 提取血红蛋白的原因是什么？提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红

11、细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于进行，便于进行DNADNA 的提取；的提取； 人和人和哺乳动物哺乳动物的红细胞无细胞核，结构简单，血红的红细胞无细胞核，结构简单，血红 蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。1.1.洗涤红细胞洗涤红细胞洗涤过程：洗涤过程：血液 100mL3g柠檬酸钠低速短时 间离心 2 min红细胞血 浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min 重复洗涤3次，直至上清液没有黄色速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞 等一同沉淀，达不到分离的效果1.1.洗涤红细胞洗涤红细胞阅读思考：阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的

12、目的是什么？除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白 的分离纯化的分离纯化2.2.释放血红蛋白释放血红蛋白阅读思考：1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析： 1. 蒸馏水的作用是_。 2. 加入甲苯的作用是_。 3. 充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂蒸馏水和甲苯3. 3.分离血红蛋白分离血红蛋白分离过程红细胞破 碎混合液高速离心 10min 离心管滤纸过滤脂类物质烧杯2000r/min的速度3、分离血红蛋白溶液有机溶剂 无色透明的甲苯层脂类物质 白色脂

13、溶性物质沉淀层血红蛋白溶液 红色透明液体红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物4 4、透析、透析-血红蛋白的血红蛋白的粗分离粗分离：过程：过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透 析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的 磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 透析目的透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。实验操作实验操作 原理：透析袋能使小分子自由进出，而大原理：透析袋能使小分子自由进出，而大 分子保留在袋内。分子保留在袋内。透析过程动画演示透析过程动画演示（二）纯化（二）纯化凝胶色谱法凝胶色谱法1. 1.凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作2. 2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱

14、柱的装填3. 3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱1、凝胶色谱柱的制作：实验操作： 样品处理粗分离纯化纯度鉴定色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞 安装色谱柱2 2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填步骤骤 操作要求不能有气泡存在 计计算称量凝 胶 配制悬悬浮液装填悬悬浮液缓缓冲液洗涤涤 平衡注意：注意：正确的加样操作（1）不要触及和破坏凝胶面（2 ）贴壁加样（3）使吸管管口沿管壁环绕移动。3 3、样品加入与洗脱、样品加入与洗脱装配好的凝胶柱（三）纯度鉴定（三）纯度鉴定SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋 白质的分

15、子量时，可选用白质的分子量时，可选用一组已知分子量的一组已知分子量的 标准蛋白同时进行电泳标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的，根据已知分子量的 标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和 分子量的对数作标准曲线，可以分子量的对数作标准曲线，可以测定测定未知未知蛋蛋 白质的分子量白质的分子量。收集得到的纯化后的蛋白观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见（见 教科书图教科书图5-185-18），），如果分层不明显，可能是如果分层不明显，可能是 洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此此 外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞 和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细 胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三三. .实验结果分析与评价实验结果分析与评价1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能、你是否完成了对血液样品的处理？你能 描述处理后的样品发生了哪些