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1、卵巢上皮性浆液性肿卵巢上皮性浆液性肿 瘤中瘤中 KDRKDR mRNAmRNA 的表达的表达 及临床意义及临床意义【关键词】卵巢肿瘤 【摘要】 目的 研究检测卵巢上皮性浆液性肿瘤中 KDR mRNA 的表达及其临床意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增 KDR 基因，以 -actin 基因作为内对照，结合凝胶图像扫描，以 KDR/-actin 作为 KDR 相对表达量分析卵巢上皮性浆液性肿瘤 70 例。结果 卵巢浆液性癌及卵巢交界性浆液性瘤中 KDR mRNA 的表达高于卵巢良性浆液性瘤及正常卵巢。在卵巢上皮性浆液性癌中，KDR mRNA 的表达与 FIGO分期、腹腔细胞学检查
2、结果、有无淋巴结转移、有无盆腔粘连有关。结论 KDR 在卵巢癌的发生、发展及转移中起重要的作用。关键词 卵巢肿瘤 KDR 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）Expression and role of KDR mRNA in patientswith epithelia ser-tumor of ovary Zhou Ye，Wang MinDepartment of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Shenyang Medical University，Shenyang110024. 【Abstract】 Objective T
3、o explore the expression and clinical significance of kinase insert domain-containing receptor（KDR）mRNA in epithelia ser-tumor of ovary.Methods Revert polymerase chain reaction（RT-PCR）and gel-image analysis system were used to analyse the expression of KDR mRNA in70cases with ovarian tumor.Results K
4、DR mRNA in cases with ovarian serous carcinoma and borderline ovarian serous tumor expresses more than that in cases with ovarian serous tumor and normal ovarian tissue.In cases with ovarian serous carcinoma，KDR mRNA expresses differently in FIGO，and，in two groups with different result of adbominal
5、cavity cells examination in two teams that with or without lymph node metastasis and in two teams with or without the pelviccavity adhesion.Conclusion KDR mRNA maybe play an important role in the express carcinogensis，development and metastasis in ovarian serous carcinoma.Key words ovarian tumor kin
6、ase insert domain-containing receptor（KDR） reve rsetranscription-polymerase chain reaction（RT-PCR）实体肿瘤的生长、代谢及转移需要持续的肿瘤血管生成。在众多新生血管诱生剂中，血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促进肿瘤血管生成的最重要的因子之一。近年来的研究资料证明 VEGF 是通过与其特异的受体-KDR（Kinase insert domain-containing receptor）相结合发挥作用的。KDR 属于细胞表面的酪氨酸
7、激酶受体，主要在血管内皮细胞表达，但在其他组织细胞也检测到 KDR 的表达，如巨噬细胞和某些血液细胞、肿瘤组织。本研究用 RT-PCR结合计算机条带密度半定量方法检测各种卵巢肿瘤组织 VEGF 受体 KDR mRNA 的表达水平并进行统计学分析。为在分子水平干预肿瘤血管增生及预防卵巢癌转移、复发提供依据。1 材料与方法1.1 研究对象 选取 2000 年 3 月2002 年 3 月在中国医科大学第二临床学院妇产科行手术切除的卵巢上皮性浆液性肿瘤组织的患者，年龄 2070 岁，平均 43.1 岁。包括卵巢浆液性癌 30例，卵巢交界性浆液性瘤 10 例，卵巢良性浆液性瘤 30 例。卵巢浆液性癌 F
8、IGO 分期（1986 年）:、期 8 例，、期 22例;组织学分级高分化 8 例，中、低分化 22 例;腹腔细胞学检查阳性 24 例;淋巴结转移 14 例;伴盆腔粘连 20 例。标本均经病理检查证实。选用来自全子宫切除同时行卵巢切除的 10 例正常的卵巢组织作为对照。切下的组织标本用生理盐水冲洗 3 次后，装于 0.1%DEPC 水处理过的干燥试管中，30min 内置于液氮中，然后置于-70的冰箱中保存待检。1.2 方法1.2.1 主要试剂 提取总 RNA 的 TriZol 试剂为美国 Promega 公司产品。RT-PCR 试剂盒由大连宝生生物工程有限公司提供。引物由北京奥科生物有限责任公
9、司合成。电泳用琼脂糖由沈阳联星生物公司提供。1.2.2 引物合成 KDR 引物序列为:P 1 :5-TAT ATA TGG TGT AAC CCG GA-3（1182-1201）;P 2 :5-TTT GTC ACTGAGACAGCTTGG-3（1176-1736） 。内参照 -actin 引物序列为:P 1 :5-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3;P 2 :5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3;KDR 扩增片段长度为 555bp，-actin 扩增片段长度为 690bp。1.2.3 RNA 提取及 cDNA 合成 提取后 1l RNA 加入 cDNA 合成反应
10、体系，以 90孵育 3min，4230min 合成 cDNA。1.2.4 PCR 扩增 取已合成 cDNA1.5l 加入 PCR 反应体系，941min，552min，721min，在扩增仪上进行如此 35 个循环。1.3 电泳和图像分析 取 PCR 产物 7l 加在含 0.5g/ml EB 的琼脂糖胶电泳中，紫外光检测仪上出现 555bp 的分子条带为阳性结果。以结肠癌 KDR mRNA 提取物作为阳性对照，以蒸馏水代替 mRNA 提取物作为空白对照，以 -actin 作为内对照。各种卵巢肿瘤组织标本的 KDR PCR 产物水平，通过电泳后条带密度与内对照密度的比值进行定量评估，计算公式为D
11、KDR=DKDR/D-actin 。1.4 统计学方法 用 SPSS 软件对实验结果进行统计学分析。KDR mRNA 表达水平采用 2 检验。相对含量采用方差分析和 t 检验。2 结果2.1 KDR 在各种卵巢肿瘤组织中的表达及含量 各种卵巢肿瘤组织中 KDR mRNA 经 RT-PCR 扩增产物表达率及相对含量结果见表1。由表 1 可以看出，KDR mRNA 在四种组织中均可表达。KDR mRNA在卵巢浆液性癌及卵巢交界性浆液性瘤组织中的表达与在卵巢良性浆液性瘤组织中结果比较差异有非常显著性（P0.05） 。但在卵巢浆液性癌与卵巢交界性浆液性瘤组织中，KDR mRNA 的表达结果差异无显著性
12、（P0.05） 。表 1 各种卵巢上皮性浆液性肿瘤与正常卵巢组织中 KDR mRNA表达水平比较 略但卵巢浆液性癌组织中 KDR mRNA 的相对含量明显高于其它三组，经统计学分析，其差异有非常显著性（P0.05） 。2.2 KDR mRNA 与卵巢浆液性癌临床病理特征的关系 见表 2。由表 2 可以看出，KDR mRNA 的表达率及相对含量在卵巢浆液性癌临床分期、期组与、期组的结果比较差异有显著性（P0.05） 。表 2 KDR 的表达与临床病理特征的关系 略3 讨论血管生成为实体瘤生长和转移所必需。VEGF 是新生血管形成中最重要而直接的血管内皮细胞刺激因子。近年来的研究表明，在缺失 VE
13、GF 另一受体-Flt-1 基因的细胞中，用 VEGF 激活 KDR后可导致细胞有丝分裂;但在缺乏 KDR 基因的细胞中，用 VEGF激活 Flt-1 后则不能诱导细胞增殖。因此，认为 KDR 可能是VEGF 发挥主要功能的受体 1 。VEGF 不仅通过激活血管内皮细胞的受体诱导血管形成，间接促进肿瘤细胞的生长，而且还可通过激活肿瘤细胞上的受体，直接促进肿瘤的生长 2 。VEGF 与受体结合后，能特异性激活血管内皮细胞膜上的酪氨酸激酶而发生一系列生物效应，如促进血管内皮细胞的增殖，增加血管的通透性，改变细胞外基质等。VEGF 也只有与受体结合后才能发挥其生物学作用 3 。在正常情况下，KDR
14、仅存在于血管内皮细胞和一些肿瘤细胞中，表达水平很低，大多数组织中不能检出。但是，当条件发生改变时，情况也发生变化。本研究结果显示，KDR mRNA 在卵巢浆液性癌及卵巢交界性浆液性瘤中的表达率、相对含量明显高于正常及卵巢良性浆液性瘤组织，而在卵巢良性浆液性瘤组织与正常卵巢组织之间以及卵巢浆液性癌与卵巢交界性浆液性瘤之间，KDR mRNA 的表达率、相对含量则差异无显著性。Boocock 等 2 报道的结果与我们的研究结果相一致。提示 KDR 与卵巢恶性肿瘤的发生、发展有关，可作为判断卵巢肿瘤良、恶性的指标之一。卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤，随着医学进步，临床诊治水平明显提高，但 5 年存活率仍很
15、低，约为 20%30%。转移是卵巢癌临床治疗失败的主要原因，很多外观局限的肿瘤却早已发生了亚临床转移。血管生成是肿瘤生长和转移的基础，新生血管为肿瘤提供足够的营养物质和氧，运走代谢产物，因此，肿瘤细胞的浸润和转移依赖于新生血管的形成。本研究表明，KDR mRNA 的表达与 FIGO 分期、腹腔液细胞学检查结果及有无淋巴结转移有关，这提示着 KDR 与肿瘤的生长和转移密切相关。另外，本研究中，KDR mRNA 的表达与盆腔有无粘连密切相关。Wiczyk 等 4 曾报道，盆腔粘连程度也是卵巢癌预后的一项指标。VEGF 通过与 KDR 相结合，能促进盆腔内粘连形成，有利于肿瘤细胞扩散，加大肿瘤细胞减灭术难度及危险性，使患者预后更差。近年来，不少学者研究认为，KDR 是卵巢癌患者独立的预后因素，若与 VEGF 同时表达，提示预后更差 5，6 。所以，KDR 不仅与卵巢肿瘤的良、恶性有关，而且与肿瘤转移及其预后有关，它可能成为反映卵巢肿瘤生物学行为和指导临床治疗、判断预后的有价值的指标。总之，KDR 在卵巢癌的发生、发展及转移中发挥重要的作用。近年来，以新生血管为靶点对肿瘤进行生物治疗已成为研究热点。VEGF 及其受体为肿瘤的药物治疗和基 因治疗提供了特异性较高的靶点，可与其它抗肿瘤药物作者：周晔王敏
