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1、第二章 基因工程 的酶学基础磷酸二酯键磷酸二酯键核酸酶：生物体内存在一类对DNA和RNA作用的酶 。DNA酶：RNA酶：限制性内切酶：能使DNA分子在内部特定的位点 上断裂的酶。核酸外切酶：从DNA分子末端移去核苷酸的酶。反转录酶：以mRNA为模板合成出互补DNA的酶。 DNA连接酶：能使DNA分子连起来的酶。基因工程的工具酶基因工程的工具酶教材教材P12P12v1、掌握一些重要的酶的概念、特点、反应特征和 应用。v2、掌握一些重要的酶的作用机制及应用。v3、掌握DNA的片断化、连接和重组的一些方法、 技术及应用。本章要点本章要点本章的主讲内容（6学时，3次课 ）第一节 限制性核酸内切酶第二节
2、 DNA连接酶第三节 DNA修饰酶 第四节 基因工程其它 工具酶第一节 限制性核酸内切酶要点介绍1、了解并掌握一些基本概念的掌握如限制性核酸限制性核酸 内切酶、同尾酶、同裂酶、识别序列、切割位点内切酶、同尾酶、同裂酶、识别序列、切割位点 、位点偏爱等。、位点偏爱等。2 2、了解酶的命名方法。、了解酶的命名方法。3 3、掌握限制性核酸内切酶的种类及区别、识别序、掌握限制性核酸内切酶的种类及区别、识别序 列及特征、作用机制、反应体系和影响因素等。列及特征、作用机制、反应体系和影响因素等。4 4、了解内切酶的性质、功能和应用。、了解内切酶的性质、功能和应用。5 5、掌握、掌握DNADNA分子片断化的
3、方法。分子片断化的方法。第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶主要为细菌、少数霉菌和蓝藻第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶R/M体系vR/M体系组成：寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶vR/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解第一节 限制性核酸内切酶来源识别序列切割位点作用机制基因工程中的应用教材教材P13,P13,表表2-12-www./ rebase数据 库第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶教材P39第一节 限制性
4、核酸内切酶教材P39第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶P46在PH不合适，或甘油浓度过高10%时， 限制性内切酶的切割位点会出现非专一性， 因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。 第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶四、酶切反应第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶第一节
5、 限制性核酸内切酶第二节 DNA连接酶要点： 连接酶的种类 特征和区别 反应机制 影响反应的因素科学家发现细胞中线状的DNA 分子经常能够自动环化起来， 形成稳定的环状结构。而在体 外，线状的DNA分子虽然也能 够自动环化起来，如果没有任 何其它酶的作用，这种结构将 是很不稳定的，容易在加热后 重新解开成线状。1967年，世 界上有数个实验室几乎同时发 现了一种能够催化两条DNA的 末端之间形成磷酸二酯键的 酶，即DNA连接酶。 第二节 DNA连接酶第二节 DNA连接酶E.coli DNA 连接酶 DNA连接酶 是由大肠杆菌染色体编码的 T4 DNA连接酶， 是由大肠杆菌T4噬菌体 DNA编码
6、的。 连接酶的来源P21（3 3）热稳定）热稳定DNADNA连接酶连接酶三三两种酶的区别？ 表2-4v1、两种酶来源不同。 v2、两种酶的作用机理不同（能源辅助因子不同）。 v3、DNA体外连接方式不同。 (1)、用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断。v4、作用对象不同。(2)、用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或 是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上 poly(dA)-poly(dT)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来.第二节 DNA连接酶酶酶-AMP-AMP复合物生成复合物生成第二节 DNA连接酶DNA连接酶 NAD+T4 DNA连接酶 AT
7、P教材P22第二节 DNA连接酶第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶体系-反应程序第二节 DNA连接酶第三节 DNA修饰酶理解DNA修饰酶的作用掌握DNA修饰酶的种类、特征、区分掌握DNA修饰酶的用途v 在DNA的切割与连接过程中，经 适当的限制性核酸内切酶处理或机械 法处理产生的DNA片段，其末端是各种 各样的。相同的粘性末端容易连接， 而其它类型的末端连接都比较困难， 在适当的情况下必须对这些末端进行 各种“修饰打扮”，才有可能被连接 酶顺利地连接起来。v 生物体内存在着各种类型的修饰 酶，能为DNA或RNA分子的末端进行各 种“修饰打扮”，如末端脱氧核糖核 苷酸转移酶、T4多核苷酸激酶
8、和碱性 磷酸酶等等。第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶1） 碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌或小牛肠道，可 以去掉DNA分子的5端的磷酸基团。2） T4多核苷酸激酶： 来自于T4侵染的大肠杆菌， 它能催化-磷酸从ATP分子上转移给DNA或者RNA的 5-OH末端，在5端增加磷酸基团3） 末端脱氧核苷酸转移酶：来自于小牛胸腺组织 ，在DNA分子的3端增加一个或多个脱氧核苷酸。第三节 DNA修饰酶末端转移酶，是从小牛胸腺中提 取的。该酶能催化5脱氧核糖 核苷酸进行53方向的聚合 作用，逐个地将脱氧核糖核苷酸 分子加到线性DNA分子的3-OH 末端，给DNA的3-OH末端加上 一个多脱氧核糖核苷酸的
9、同聚物 尾巴。第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶vT4多核苷酸激酶 在DNA分子克隆中 的主要用途是： 标记分子的5 -末端；使缺失 5-P末端的DNA 补上磷酸，发生 磷酸化 第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶第三节 DNA修饰酶第四节 其它工具酶了解一些其它酶的作用和用途v核酸外切酶 基因操作过程中经常要针对性地降解掉DNA双链 中DNA-RNA杂种双链分子中的一条链，以满足某些特 殊的实验要求，达到特殊的实验目的。这时会经常 用到一些核酸外切酶。核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始 按序催化降解核苷酸的酶。按作用的特性差异可以 将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。第四节 其它工具酶P53第四节 其它工具酶发夹结构第三节 DNA聚合酶和反转录酶第三节 DNA聚合酶和反转录酶 DNA聚合酶
