发酵调控学(复习)

《发酵调控学(复习)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《发酵调控学(复习)（122页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、发酵调控学生物工程学院 储 炬课程内容1 微生物生长分化调节的规律 (1)细胞周期内有关生长的活动，DNA合成与细胞 分裂的调节 (2)丝状菌生长分化的调节 2 初级代谢的调节机制 (1)调节的生化基础 (2)代谢调节的方式与内容：诱导、分解代谢物调 节、反馈调节课程内容3 次级代谢物的生物合成的调节 (1)次级代谢物的概念 (2)生物合成的前体 (3)次级代谢物的生物合成 (4)抗生素生物合成的控制课程内容4 发酵过程控制 (1)控制的策略 (2)参数的指导作用 (3)参数相关分析 (4)过程控制的评价主要参考书现代工业发酵调控学，储炬，李友荣，化 学工业出版社，北京。2002年1月Biot

2、echnology, 2nd ed. Vol.1; Biological Fundamentals. Rehm H-JBBiotechnology, 3nd ed Vol.3;Bioprocessing.Rehm H-JB微生物发酵代谢调控与发酵过 程优化技术代谢调控是研究内在的调节机制 ，而过程优化则是外在控制，是 建立在相关参数的分析上的，这 两个方向相辅相成，前者为后者 的基础，而后者是使理论变为现 实的手段。1微生物生长与调节为了控制菌体的生长，需要了解生长的 方式，细胞分裂和调节的规律，测量微 生物生长的各种办法，微生物生长繁殖 的形式与工业生产的关系，环境变化对 微生物生长的影响。

3、因此，研究微生物 的生长分化规律无疑是发酵调控原理的 一个重要组成部分。细胞周期对于个体细胞行为，主要关心染色体启动、复制和分离新细胞壁材料的合成与插入协调染色体复制和细胞分裂的信号细胞周期细胞周期(Cell cycle)：细胞的一系列可鉴别的周而复始的 生长活动。这些活动的顺序不变, 完 成一个活动后才能进行下一个活动 。图1 细胞周期细胞周期典型的真核生物细胞周期如图所示: S, M 和G1, G2分别代表DNA 合成, 有丝分裂期 和两次间隙。若生长速率因养分多寡而改变, S, G2 和M 几乎不变, 只有G1改变。MTG: mean generation time细胞周期原核生物在低生

4、长速率下的细胞周期, 与 真核生物相似。其染色体复制期C 相当于 S；细胞分裂期 D相当于G2+M；C 和D 不随生长速率变化, 只有G1可变动 。细胞周期的各项活动怎样去适应生长 速率变化的需要？染色体复制与细胞分裂的调节染色体复制怎样与细胞分裂协调？在高速生长下, 如细胞周期为30 min, 染色 体复制不能在一个周期内完成。 为此，未等前一轮复制结束，后一轮复制又 在原点上启动。 可以把C 期的启动和终止,以及细胞分裂看作 是不可更改的活动顺序, 称为C+D 周期。染色体复制与细胞分裂的调节若增代时间少于 C+D时间, C+D 周 期重叠，其重要特征是分配到子细 胞的染色体已开始新的一轮

5、复制。 这类染色体称为二叉染色体 (dichotomous)。图2大肠杆菌的染色体复制和 细胞分裂的时间分配示意图染色体复制和细胞分裂的调节 规律染色体复制未完成， 细胞就不会分裂。 不管生长速率如何，大肠杆菌的细胞分 裂总是出现在染色体复制完成之后。不管生长速率如何，C 和D 所需时间大 致不变。C 和 D可以依次或同时(指上一轮的 D和 下一轮的C ) 进行。思考题加倍时间最小为多少？C40，D20时，时间如何分配？染色体复制的启动染色体复制的启动受启动因子 (origin), 一种特异调节性蛋白的正 向控制。当启动因子增加到某一临 界水平, 启动便开始。在这以后启动 因子被毁或稀释。合成

6、启动因子达 到有效浓度所需的时间恰好等于培 养物增代时间。染色体复制的启动大肠杆菌在启动时的启动因子数量与细 胞质量之比在各种生长速率下是一样的 。这一比例实际上是染色体启动因子的 浓度。细胞似乎能检出启动因子的浓度 。当它达到一临界值时便启动新一轮的 复制。启动的直接后果是启动因子的浓 度提高一倍。染色体复制的启动启动不会重新发生直到其浓度因生 长而降到临界值。这种控制机制构 成一种生物钟。它是以细胞体积或 其它有关参数为依据。据此，染色 体复制的启动频率是DNA 合成速率 的控制步骤。染色体复制的启动O/M=I 启动， 启动后，2O/M=I, II 不再启动， M增加，M 2M，使I逐 渐

7、下降， 2O/2M=O/M=I， 又开始启动。启动和复制是性质截然不同的 两种过程启动的过程需要蛋白质合成，如蛋白质合成受阻 ，已启动的DNA合成能完成，但不能启动新一轮 DNA合成 。曾检出其产物负责启动而不负责随后复制的基因 ；加入利福平或氯霉素抑制RNA或蛋白质合成或除 去营养缺陷型所需的氨基酸都能阻止启动，但允 许复制继续完成；培养物进入稳定生长期后，中止生长的细胞含有 完整的染色体。染色体复制的启动 启动总是在染色体上的专一位置上进行 。此位点称为复制或染色体原点。在大 肠杆菌此位点很靠近ilv座位。在大肠杆菌和枯草杆菌中复制叉以两个 方向沿染色体运行，大约在离原点180度 地方相遇

8、。染色体复制的启动启动的频率取决于细胞量增长的速 率，即生长停止，启动也随着停止 是预料中的事。细胞周期的研究方法1 镜检法用电子显微镜观察单个细胞的生长，定 时拍照。由此发现大肠杆菌在分裂时细 胞个子的变化不大。细胞周期的研究方法1 镜检法说明似乎存在一种控制细胞个子大 小的因子，即尺寸因子(size factor), 可能是启动细胞质量 (initiation mass)。 1 镜检法缺点:细胞由培养液转移到固体 表面,会受到干扰。细胞年龄变化较大时,细胞大小 变化不大。2 同步培养(Synchrony)法 (1) 密度梯度离心沉降法 按细胞的大小/年龄把在对数生长期的培养 物分级。H2O

9、/D2O密度梯度沉降法:能应用于任何品种, 不会施加渗透压强 的影响。从某一密度带便可分离出同质的细胞群体 ，随后培养。细胞大小的分布频率与蛋白质 合成速率的关系细胞大小的分布频率与蛋白质 合成速率的关系蛋白质合成速率与细胞长度(体 积)成正比，从而与细胞年龄成 正比。(2)过滤洗脱法 将细胞粘附在固体支持物，如硝化 纤维膜上，然后将其倒置，让生长 培养基从上到下通过，新生的细胞 便被洗脱到培养基中，呈一种特征 性的振荡模式，见图123。过滤洗脱法(2)过滤洗脱法在初始冲洗(wash-off)期后从滤膜上 洗脱下来的主要是新分裂的细胞。 在洗脱曲线高峰下从膜上洗下的细 胞是沉积在膜上的新生细胞

10、后代， 那些在低峰下的是其沉积时正要分 裂细胞后代。过滤洗脱法洗脱(wash- off)的振荡模式可以 测出细胞周期。3 同位素示踪法 如亲本培养物沉积在滤膜上之前用 氚标记的胸苷使细胞带上标记，则 结合到洗脱细胞的标记量与结合到 亲本培养物那一年龄细胞的标记量 成正比。细胞周期细胞周期其一个洗脱峰(后代)带有比前一代少 一倍的放射性标记。可以分别求得C和D值3 同位素示踪法另一种研究细胞周期的方法是通过 蔗糖密度梯度离心，使一对数生长 的培养物沉淀, 收集最上层的细胞， 在含有氚-标记胸苷的生长培养基上 生长，测量其DNA合成速率。3 同位素示踪法洗脱前在无标记培养基中生长，洗 脱时用带标记

11、的培养基，得到的带 标记DNA呈阶梯上升状。细胞周期4 生长速率与细胞个子大小的 关系生长培养基越丰富，细菌生长速率 加快，其细胞的个子也越大。如在同一种培养基内改变温度也会 影响生长速率，但对细胞个子大小 几乎没有多大影响。4 生长速率与细胞个子大小的 关系如一细胞的增代时间为60min，在细 胞分裂时染色体复制便开始启动。 假设细胞这时具有质量为M (启动细 胞量=1/启动因子浓度)。4 生长速率与细胞个子大小的 关系个体细胞的量在指数地增加，直到 2M，细胞便开始分裂。此时从培养液中检出新生的细胞， 置于较丰富的培养基 (能使菌快速生 长, 增代时间为35 min) 中，并假定 细胞迅速

12、调整到新的生长速率。4 生长速率与细胞个子大小的 关系这样，个体细胞量增长速率往上移 动，如C+D规律还适用，下一个细 胞分裂的时间不会变动，但细胞个 子会增大。新一轮复制的启动将在细胞分裂前 便开始。4 生长速率与细胞个子大小的 关系换句话说，C+D 周期现在开始重叠 。快速生长经一个细胞周期后便达 到新的平衡。生长速率越快，细胞 个子的差异也越大。生长速率对细胞个子和染色体 复制启动时间的影响生长速率对细胞个子和染色体 复制启动时间的影响可用式1-27 表示细胞周期t对指数培 养物的细胞个子平均大小M 的影响 。M = K2(C+D/t) (1-27)曲线的形状将取决于C，D 和K 是否

13、变，只有在简单情况下logM与t作曲 线才会得一直线。细菌培养物的生长周期在一来自静止期细胞的培养物的生 长期间，在细胞数目开始增加以前 有一相当长的停滞期。细胞量开始 增长的滞后现象短一些。细菌培养物的生长周期如达到物态的指数生长，则所有可测的 参数也将平行地增长。当培养物进入静止期便发生与上述相反 的活动顺序。因启动速率比细胞分裂早减速CD分钟 。细胞量增长下降时，细胞分裂继续指数 进行，细胞渐渐变小。细菌培养物的生长周期细菌培养物的生长周期新的一轮DNA复制的启动频率 取决于新细胞量的积累速率，则 吸光度与细胞数目至少有CD 分钟不平行。生长速率和DNA浓度细胞中的DNA%随生长速率的增

14、加而下降 ，可用式1-28表示: G/M=/(KC ln2)(1-2-C/) (1-28)式中G 是基因组的当量，为每个细胞的 DNA 平均值。生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响展示了3种质量倍增时间： a) 70 min， b) 40 min， c) 20 min生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响一个启动细胞量单位含有一个刚开始一 轮复制的染色体。用一水平线C 分钟长 度表示。它在纵轴上所处高度代表细胞 量。假定细胞量的复制时间为70 min， 见图1-28a，将出现轮与轮复制的间隙。 当细胞量增加到三倍时它将完成4 个复 制好的染色体。生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的

15、影响如在零小时把细胞置于增代时间为40 min的培养基内，见图1-28b，则新一轮 复制将紧跟在上一轮复制完成之后开始 ，轮与轮之间不存在间隙。待细胞量增 到3个单位时，第二轮的复制将不会完成 。结果得到2条复制了一半的染色体， DNA浓度下降到3/3。生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响如将细胞置于增代时间为20 min的培养 基内, 在第一轮复制还未完成前第二轮复 制已开始。当细胞量达到3 时, 只有一个 带三个复制叉的染色体，见图1-28c， DNA 浓度进一步下降到2.25/3。生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响生长速率影响染色体上不同位 置的相对基因拷贝数 在一随机的指

16、数培养物中，接近原点处 的基因，其拷贝数总是居多，靠近两端 的较少。 这种相对基因剂量的倾斜度随生长速 率的增加而提高。生长速率影响染色体上不同位 置的相对基因拷贝数DNA的浓度随生长速率的增加而下 跌，从而不同程度地影响基因浓度 。那些靠近染色体原点的基因浓度 没有变化；位于中间的基因平均浓 度则只有原点周围的一半左右；处 在染色体复制近末端的基因浓度最 低。生长速率影响染色体上不同位 置的相对基因拷贝数在一个细胞周期内，一个基因浓度 相对另一个而言，可相差4倍。生长 速率对不同作用，提供了一种解释 非随机基因次序的理由。生长速率影响染色体上不同位 置的相对基因拷贝数据此，对生长速率有限制作用的应 位于靠近染色体原点处。其实，这 是为什么大肠杆菌中有6 个拷贝编码 核糖体RNA的基因都聚集在原点的 附近的缘故。生长速率对细胞组分的影响每个细胞RNA随生长速率的变化可以达10倍之 多。在快速生长的细胞