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1、LOGO血清-球蛋白的分离、 纯化及鉴定实验十一 扬州大学医学院生化教研室傅 奕Contents实验目的与要求实验原理操作步骤结果分析1234血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定一、实验目的与要求u了解分离纯化蛋白质的基本原理;u掌握柱层析技术。二、实验原理本实验为一综合性大实验,目的是要从血清中获得纯化的-球蛋白。血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定血清中的蛋白质有两大类:清蛋白和球蛋白(、)。(一)如何分离得到球蛋白?盐析: 清蛋白在水中的溶解度大于球蛋白,在血清中加入硫酸铵至半饱和时,球蛋白可被完全沉淀,而绝大部分清蛋白保持溶解状态,依此可将球蛋白和清蛋白分离 (离心)。得到球蛋白二、实验原理血清-
2、球蛋白的分离、纯化及鉴定(二)如何去除球蛋白中的无机盐(硫酸铵)?凝胶层析(凝胶过滤)脱盐凝胶层析又称凝胶过滤, 是选用孔隙大小一定的凝胶, 将混合液中的小分子和 大分子物质“筛”开来的 一种分离方法。葡聚糖 G-25纯化的球蛋白二、实验原理血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定(三)如何分离得到纯化的-球蛋白?在乙酸铵溶液(pH6.5)中 、-球蛋白带负电荷而-球蛋白带正电荷二、实验原理血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定(三)如何分离得到纯化的-球蛋白?如何将带有不同性质电荷的蛋白质分离呢?离子交换层析:利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 离子交换是指溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的交换过程
3、;带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂;带负电荷的交换剂称阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂,其分子带电形式为:纤维素-OC2H4N+H(C2H5)2,溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合,带正电荷的离子则不能,这样便可达到分离纯化的目的。 血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定+二、实验原理血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定(三)如何分离得到纯化的-球蛋白? 因、球蛋白带负电荷而与DEAE纤维素进行交换结合。 而-球蛋白带正电荷而不与DEAE纤维素进行交换结合,直接从层析柱流出。 故经DEAE纤维素阴离子交换层析流出的第一部分蛋白质即为纯化的-球蛋白。 纯化前后的-球蛋白可用电泳法
4、进行比较鉴定。 (四)如何鉴定-球蛋白及纯度?二、实验原理血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定1.盐析:分离球蛋白与清蛋白。 2.凝胶层析:去除球蛋白中的无机盐(脱盐)。3.离子交换层析:将-球蛋白与、-球蛋白分离。4.电泳:鉴定-球蛋白及纯度。三、操作步骤血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定1.盐析:分离球蛋白与清蛋白 取血清0.75 ml,缓慢滴入饱和(NH4)2SO4溶液 0.75 ml,边加边摇,混匀后于室温中放置10分钟,然后10000rpm离心10分钟,并小心倾去上清液。沉淀加蒸馏水0.4 ml,使之溶解,即为粗提的球蛋白溶液。三、操作步骤血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定2.凝胶层析:去除球蛋白
5、中的无机盐 (脱盐)(1)装柱:(a)固定层析柱,保持垂直。 (b)排气,并检查是否通畅。柱内留下约5ml乙酸铵。 (c)灌胶:用滴管沿管壁自顶部加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液,打开底部出口,凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降,不断加入SephadexG-25,至凝胶层积集至约15cm高度即可,床面上保持有少许溶液。关闭出口。 避免气泡、纹路,凝胶面始终低于液面。 如凝胶表面不平时,可用玻棒轻轻搅动,让凝胶自然沉 降,使表层平整。三、操作步骤血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定(2)上样与洗脱:凝胶面始终低于液面使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面 用滴管吸取盐析球蛋白液,小心缓慢地加到凝胶
6、床表面上 然后打开下端出口,使样品进入凝胶床,关闭出口 小心加入少量乙酸铵(约1ml)洗层析柱内壁上的样品, 打开出口,使溶液进入凝胶 加入适量乙酸铵溶液开始洗脱并收集洗脱液,每分钟收集15滴 淡黄色仔细清洗试管三、操作步骤血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定(3)洗脱液中蛋白质的检测: 按洗脱液的管号顺序分别取1滴液体,滴于玻片上,滴加20磺基水杨酸1滴,出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出,由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。合并蛋白含量高的各管,此即已脱盐的球蛋白溶液,除留少量作电泳鉴定用外,其余用于DEAE-纤维素阴离子交换柱。最多合并三管即可三、操作步骤血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定3.
7、离子交换层析:将-球蛋白与、-球蛋白分离。(1)装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测 装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测等操作步骤及有关注意事项同前述。上样前DEAE-纤维素柱的平衡:装柱后用0.02 M乙酸铵(pH6.5)冲洗2遍。 将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE-纤维素阴离子交换柱上,用乙酸铵洗脱,样品进入柱床后立即开始收集洗脱液,检查各管的蛋白质分布情况,合并含量高的各管。留少量做电泳此次收集的即为纯化的-球蛋白溶液,留待浓缩及鉴定。三、操作步骤血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定(2)浓缩将纯化的-球蛋白溶液量体积,每毫升加葡聚糖凝胶G-25干胶0.25g,摇动2-3分钟,离心5分钟(10
8、000r/min),上清即为浓缩的-球蛋白溶液,留待电泳鉴定。三、操作步骤血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定4.电泳:鉴定-球蛋白及纯度 (比较纯化前后的蛋白质) 每组取醋酸纤维素薄膜3张,按如下操作:样品:(1)血清;(2)凝胶层析脱盐后的球蛋白溶液;(3)DEAE-纤维素阴离子交换柱纯化后的-球蛋白液电泳及染色:方法同醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验。 (点样面朝下、点样端靠近负极,氨基黑10B染色)不可重复点样须重复点样须重复点样, 约15次左右血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定 葡聚糖G-25 和DEAE纤维素:实验结束 后,用乙酸铵冲洗3遍后,回收至原烧 杯。u注意:四、结果分析血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定比较电泳结果,然后作出分析。