《长链非编码RNA在骨肉瘤患者中的差异表达研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《长链非编码RNA在骨肉瘤患者中的差异表达研究（131页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 博士学位论文中文摘要原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：斗届，、例学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国
2、科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：杯跏签中文摘要中文摘要长链非编码R N A 在骨肉瘤患者中的差异表达研究目的：l n c R N A 在基因调控中起重要作用，目前它对骨肉瘤的发病机制的影响仍不清楚。本研究利用微矩阵基因芯片技术研究l n c R N A 在骨肉瘤和癌旁组织表达谱的差异并初步探讨其生物学作用。方法：分别取9 例骨肉瘤癌组织和对照癌旁组织，提取总R N A后进行质量测定，合格后杂交合成c D N A 后经过M i c r o a r r a y 基因芯片扫描仪扫描后得到原始数据，原始数据经过统计软件转换后进行统
3、计分析，得到两种组织之间I n c R N A 和m R N A 的差异表达谱。分别选取上调的I n c R N A6 个：A S L N C 218 6 8 ，A S L N C 2 212 4 ，A S L N C 2 38 4 4 ，A S L N C 2 4 5 8 7 ，B E 5 0 3 6 5 5 ，B C 0 5 0 6 4 2 ，下调的l n c R N A4 个：A S L N C 0 0 3 3 9 ，A S L N C l1 4 3 5 ，A S L N C l 3 3 8 7 ，A S L N C l 8 8 1 4 采用S Y B RG R E E NI 实时荧光定
4、量聚合酶链反应( I m P C R ) 验证，并用G A P D H做内参。综合N C B IR e f S e q ，U C S C ，R N A d b ，L n c R N A s 等数据库资源，对芯片结果进行G e n eO n t o l o g y 、P a t h w a y s 分析等初步生物信息学分析，并通过计算P e a r s o n 相关系数( 2 0 9 5 ) 建立l n c R N A 与靶基因的基因网络图。结果：将差异表达的标准设为：F o l g c h a n g e 值 2 ，P 值- 2 1 或者 2 1时，说明R N A 可能有部分降解；在1 8 2
5、 1 之间则认为该R N A 质量可接受。本实验所提取的R N A 利用N a n o D r o pN D 1 0 0 0 分光光度计检测，A 2 6 0 A 2 8 0 值均在1 8 2 1 之间，证明提取的R N A 质量符合要求，可以进行后续试验。1 0R N A 提取质量结果见表1 - 2 ：表1 - 2 R N A 提取质量结果3 1 1 标本总R N A 完整性从变性琼脂糖凝胶电泳试验的结果图1 1 中，我们可以看出电泳分别得到了骨肉瘤组织组合对照癌旁组都有2 条清晰明亮的条带：2 8 S 和1 8 S ，且2 8 S 条带的宽度基本接近于1 8 S 条带的2 倍，这说明本试验得
6、到的总R N A 是完整、无降解及D N A 污染，可以用于后续试验。博士学位论文第一章图1 - iR N A 变性琼脂糖凝胶电泳1234567891 0l l1 21 31 41 51 61 71 83 2l n c R N A 芯片实验结果：我们选择美国A r r a y s t a r 公司提供的1 2 1 3 5 K 的H u m a nL n c R N AM i c r o a r r a y2 0 版) 芯片，该芯片收录了目前最全的I n c R N A 与蛋白编码基1 2学位论文第一章( m R N A ) ，一次杂交实验可以同时检测I n c R N A 和m R N A 的
7、表达水平，殳计了探针为6 0 m e r 的长寡核苷酸，这些长寡核苷酸探针在高严谨杂交牛下可得到高灵敏度及高特异性的实验结果。本实验以9 例骨肉瘤组织枉为一组，9 例对照癌旁组织标本为另外一组，使用A x o nG e n e P i x4 0 0 0 B牛扫描仪对杂交后的芯片进行扫描得到图像，结果如图1 2 ，每张芯片信匀匀、清晰，没有边缘化效应、阳性定位和阴性定位对照区域结果明显，凋芯片结果可用。图1 - 2 芯片扫描图正常组肿瘤组1 通过箱式图( B o xP l o t ) 分析，我们可以观察到芯片扫描后各个组织本后荧光密度值的分布，经过标准化后，所以样本的l 0 9 2 - r a
8、t i o s 基本都是同的；博士学位论文第一章图1 3B o xP l o t - l n c R N AI IIIIIlIIllII IIIIIII IIIIIIIIIlIIII瓣驯牡艟附鼬坩 mc 2b I 舢e d j n m mg d _ g ；i H m 舢K J I 椭1 1 3 m硼l _s 拥D k图1 4B o xP l o t m R N Aiiif f 1 1 f I f |川 【 I f | |l如洲般靴雠堋圳ne 1 1 m 1 1 c | 2 J l 盯“ 睇帅瑚r e _ g r a m1 1 21 1 7 jn H 哪T ，l $ h n t l O l t3
9、 2 2 通过散点图( S c a t t e rP o l t ) 分析，我们可以直观分析两组之间芯片表达数据的分布变化，散点图x 轴和Y 轴是标准化处理后的信号值，绿色的1 4博士学位论文第一章线表示折叠倍率线( F o l d c h a n g e ) ，本实验我们选定的标准是F o l d c h a n g e 2 0 ，这些位于上面绿色线之上的或者位于下面绿色线之下的表示其差异表达倍数之2 0 ；图1 5S c a t t e rP l o t - l n c R N AX - A x i s 。 N y - A x i s C 博士学位论文第一章图1 - 6S c a R e
10、rP l o t - m R N Ax - A x i s N y - A x i s C 3 2 3 通过火山图( V o l c a n oP o l t ) 分析，我们可以直观分析两组之间芯片表达数据差异的分布变化，散点图x 轴和Y 轴分别表示P 值和变化倍数，绿色分界线表示P 值小于0 0 5 和折叠倍率线( F o l d c h a n g e ) 2 0 ，红点表示表达有差异的I n c R N A ；1 6垦主兰垡笙奎笙二皇岔 三 罗go= 皇I图1 7V o l c a n oP l o t - l n c R N A1 ，! 。一。 1口尹吨尊，0o 上砖：f 曲一小! i
11、 一：0 善。之皆芒蚀j j。_ 1 ，i 且- j r 点耋一1。二_ 一呓鞋囊r 一o _ i ? ! 舀) fE 曩 1 蟛j。l 一 一汀：矿1 ： i dJ 1 璀瓣铲一42O24l 0 9 2 ( F o l dc h a n g e )S e l e c tp a i r C V 5I N 、，1 78765432l博士学位论文第一章图1 - 8V o l c a n oP l o t - m R N A口JI L “ ：r j _ - -) 八1 I l飞蓬雾甜廿一8642024680 9 2 ( F o l dc h a n g e )5 e l e c tp a i r C
12、 V 5I N 3 2 4 经过图像采集和数据分析后我们得到I n c R N A 和m R N A 的数据，设定差异表达的标准：F o l d c h a n g e _ 2 0 ，P 值三0 0 5 根据此标准筛选得到两组之间差异表达的l n c R N A 和m R N A 。筛选得到的数据显示，骨肉瘤组织组和对照癌旁组织组相比，有1 2 0 1 个l n c R N A s 表达有差异，其中上调4 0 3 个( 表1 3 ) ，下调7 9 8 个( 表1 4 ) ，其中A S L N C 0 2 7 2 4 ( F o l d c h a n g e ：7 2 2 7 6 3 5 4
13、) 是上调倍数最大的l n c R N A ，A S L N C 0 51 2 9 ( F o l d c h a n g e ：2 7 3 8 6 8 2 6 ) 是下调倍数最大的l n c R N A ；同时检测到有1 9 1 9 个m R N A s 表达有差异，其中上调9 8 6 个( 表1 5 ) ，下调9 3 3 个( 表1 - 6 ) ，其中N M0 1 2 4 4 5 ( F o l d c h a n g e ：3 3 1 7 0 9 4 ) 是上调倍数最大的m R N A ，N M0 0 5 9 6 3 ( F o l d c h a n g e ：1 7 0 3 2 0
14、3 ) 是下调倍数最大的m R N A ；1 898765432l一叫丁一呵cIo-口。一博士学位论文第一章表1 3 骨肉瘤组织与正常癌旁组织相比表达上调的l n c R N A s ( 前5 0 个)1 9博士学位论文第一章表1 4 骨肉瘤组织与正常癌旁组织相比表达下调的l n c R N A s ( 前5 0 个)S E Q _ I DF D Rp - v a l u eF o l d c h a n g er e g u l a t i o nA S L N C 0 5l2 90 0 2 0 6 7 0 8 5 70 0 0 0 l1 3 8 0 42 7 3 8 6 8 2 6A S
15、L N C 0 4 6 8 30 0 2 2 0 2 2 5 2 10 0 0 0 1 3 4 3 4 12 2 3 8 8 1 3 6A S L N C 2 1 7 9 20 0 4 0 0 7 3 1 0 40 0 0 0 5 6 9 5 7 41 3 6 0 0 8 9 1A S L N C 2 0 2 7 10 0 0 6 7 0 4 6 61 3 4 9 6 8 E 0 51 3 1 3 0 0 5 7A S L N C l l 4 3 50 0 3 4 5 4 3 9 70 0 0 0 3 9 2 8 7 11 1 6 4 7 4 2 2A S L N C 0 0 5 6 00 0
16、 3 1 0 6 5 0 3 20 0 0 0 3 1 7 3 0 91 0 5 1 7 8 5 9A S L N C l 8 2 6 10 0 2 8 9 9 2 0 7 20 0 0 0 2 7 7 6 6 59 5 5 3 2 6 5A S L N C 2 2 4 4 00 0 2 0 6 7 0 8 5 70 0 0 0l16 0 0 88 4 315 2 9A S U 、l C l 0 9 1 80 0 1 3 0 8 7 4 5 14 8 6 1 6 9 E 0 57 4 5 0 0 0 3 6A S L N C 2 4 3 l O0 0 1 9 8 2 0 1 1 60 0 0 0 1 0 7 6 0 67
