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1、 残留除草剂的检测聚乙烯醇苯乙烯吡啶聚合固定叶绿体膜的制备并用于残留除草剂检测 !实验原理在非光照条件下 ，叶绿体具有降解双氧水的抗胁迫能 力，即叶绿体束缚酶能催化双氧水分解产生O2，而绝大多 数除草剂对该反应有较强的抵抗作用。 !反应方程式2H2O2叶绿体束缚酶2H2O O2!特点研究了 PVA-SbQ 光聚合物固定化叶绿体膜的性质， 结果证明该法固定的叶绿体束缚酶具有活性高、寿命长 和使用方便等特点。聚乙烯醇苯乙烯吡啶聚合固定叶绿体膜的制备并用于残留除草剂检测 将叶绿体处理后用聚乙烯醇-苯乙烯吡啶 ( PVA -SbQ) 聚合膜进行固定 ，得到固定化的叶绿体膜，该膜中叶绿体 束缚酶能催化H
2、2O2的分解产生氧 ，而除草剂对该指示反应 有抑制作用。利用氧电极 ，建立了新的用于检测痕量除草 剂的电流分析法。4检测痕量除草剂的电流分析法4检测范围所检测的除草剂有阿特拉津、莠灭净、草净津、西玛 三嗪、扑草净、敌草隆和百草枯等，检测浓度范围分别为 0.251.75，0.040.70，0.101.10，0.100.80，0.20 1.80，0.010.12和0.0060.02mg/L。实验部分 &叶绿体的提取和固定&实验仪器 氧分析仪及氧电极 组织捣碎机 高速冷冻离心机 BH2型相差显微镜 超级恒温槽 H-600型透射电子显微镜 CliniBio-128oC酶标仪 UTL1386-3V型低温
3、冰箱 将新鲜菠菜叶片破碎，分离出叶绿体，测定其中叶绿素 的含量。再利用PVA-SbQ 光聚合技术将叶绿体固定。 实验部分 z实验试剂和实验材料PVA-SbQ规格如下：SbQ浓度为1.34102mol/L， 固态物含量10.04（质量分数w），聚合度3500，皂 化度 88；2 ，6二氯酚靛蓝（DPIP ），使用前用水 配制成3104mol/L；除草剂由原料用 2 乙醇溶液配 制，并用该乙醇溶液逐级稀释成工作液。其浓度分别为 百草枯、敌草隆各1 mg/L；阿特拉津、扑草净和莠灭津 各5mg/L 等。实验中所用试剂均为分析纯或生化试剂， 实验用水为蒸馏水；菠菜种子为香港的“超级菠菜”，土 壤培养8
4、星期，株均重25 g，晴朗天气上午 9时取叶。实验方法 氧电极的内充液为0.5mol/L KCl溶液。首先用空气饱和Na2CO3 的蒸馏水和饱和溶液对氧测定仪进行满刻度调节和调零，然后取一 片 4mm2 叶绿体固定化膜（或相同叶绿素浓度的叶绿体悬浮液）放 入内体积为2mL的反应池中，加入pH7.4的Tris-HCl 510-3mol/L MgCl2缓冲溶液1.5mL，0.08mol/L H2O2100L，加水至2mL。插入 氧电极，反应池外层通28oC恒温循环水，搅拌反应液3min，从记录 仪上读取放氧量P0。更换反应池中的溶液和固定化膜，用微量进样 器加入一定量的除草剂，测量P，计算 P=
5、P0- P。每次测量都使用 新的叶绿体固定膜。测定装置如图1。 机理讨论 与除草剂对叶绿体光合作用 Hill 反应的抑制作用的机理 不同，实验中除草剂对叶绿体抗胁迫的抑制作用主要涉及到 如下的酶反应：在抗坏血酸过氧化酶（AA-POD）的催化作用下，H2O2被抗 坏血酸（A A）氧化生成单脱氢抗坏血酸（MDA）。 MDA 可通过歧化作用生成AA和脱氢抗坏血酸（DHA）。而DHA 在脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的催化作用下，与还原性 谷胱甘肽（GSH）反应生成 AA，GSH 被氧化为氧化型谷胱 苷肽（GSSG）。GSSG则在 GR 的作用下利用叶绿体中大量 存在的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ NA
6、DPH ）作为电子供 体重新生成GSH。除草剂在避光条件下的抑制作用主要是通 过与AA-POD和GR等相关酶结合来抑制这些酶的活性。影响因素叶绿体膜的活性根据测得的PVA-SbQ固定化叶绿体膜催化降解过氧 化氢产生氧气的速率来计算膜的活性。本实验采用敌草 隆作为样品（以下实验除指明外，均采用敌草隆），结 果如图2。由图2可见，保存在-20oC冰箱中的PVA-SbQ 固定膜1个月内活性基本没有改变；5个月后，膜活性保 留仍超过50，满足实际测定要求。 影响因素叶绿体膜的活性溶液pH值的影响 叶绿体中酶抗胁迫 能力在中性和弱碱 性溶液中表现最强磷酸盐缓冲液 硼酸盐缓冲液 Tris-HCl缓冲液 碳
7、酸氢盐缓冲液溶液pH为7.4时，除草剂的抑制作 用最明显，放氧量差值达最大本实验选择pH为7.4 确定采用 Tris- HCl缓冲液温度的影响 温度对叶绿体束缚酶对H2O2的抗胁迫作用和 除草剂对该指示反应的抑制作用都有影响，故对 测定结果也有影响。实验表明：在5 27oC，随 温度升高空白溶液和含除草剂体系溶液的放氧量 都增大，且P也随着增大。但温度高于27oC时， 由于空白溶液的放氧量增加过快，P反而逐渐减 小。故选择测定温度为27oC。 过氧化氢加入量的确定 H2O2降解酶的量由PVA-SbQ固 定膜中叶绿体的数量决定 ，对 于厚度固定的叶绿体膜 ，则由 膜面积的大小决定 。膜的面积 增
8、加，叶绿体浓度增大 ，产生 的氧浓度大 ，除草剂抑制酶反 应引起的 P也增大，但膜片面 积达到6mm2 时，P反而减小。 另外，体系的空白值过大时 ， 由于产生的氧浓度太大 ，易超 出仪器量程而使测定范围变窄。 故本实验膜片面积选择4mm2。膜片面积对测定的影响 利用叶绿体束缚酶在无光照的 条件下对 H2 O2 分解产生氧的 反应作为测定除草剂的指示反 应 ，因此 ，H2 O2 的加入量对 测定有较大影响 。当 H2O2 的 量小于 2.410-4 mol/L 时，反 应的放氧量小，而使P很小， 测定的灵敏度较低 ；当 H2O2 的量大于6.0 10-4 mol/L 时， 反应杯中的氧气产生量
9、太大而 使空白值增大，结果导致测定 的检测范围很窄。综合考虑各 种因素 ，确定 H2 O2 的浓度为 4.010-4mol/L。校准曲线 按照实验方法分别测定了不同浓度范围的阿特拉津 、莠灭净、草净津、西玛三嗪、扑草净、敌草隆及百草 枯的校准曲线，结果如表1。由表1可见，百草枯测定的 浓度最低。 固化与未固化叶绿体活性的差异 取含有相同浓度叶绿素的悬浮液和固化膜，分别 测出未加除草剂的放氧量P0，计算 （P0- Pi）/ P0，结 果如表 2 。可见，利用PVA-SbQ固定叶绿体膜比用叶 绿体悬浮液检测的氧减少率高。即PVA-SbQ固定叶绿 体膜的活性高 ，用于除草剂的检测灵敏度高于叶绿体 悬
10、浮液。 不同固定方法对叶绿体膜活性的影响 取冷藏于-20oC冰箱中的含有相同浓度叶绿素的PVA-SbQ 固化膜、戊二醛 牛血清蛋白固定叶绿体膜以及海藻酸钙固 定叶绿体膜，按照上述实验方法 ，分别测定它们在放置不同 时间时对H2O2 响应的校正曲线，计算曲线的斜率，结果如表 3 。 可见，PVA-SbQ 固定叶绿体膜在不同时间下都具有比其 它两种固定化方法更高的活性。 G样品分析G 各取 500 mL 农田水样于聚四氟乙烯瓶中 ，试液经过滤 后，加入 10 mL 5 EDTA溶液。先直接按实验方法测 定，未检出其中除草剂的量；再分别加入敌草隆标准溶 液使其浓度分别为0.02 mol/L，0.05
11、 mol/L，测得加标回 收率为 89.2 98.7。另取室内盆载土壤，喷洒一定 量阿特拉津的溶液，混匀后分别称取25g样品于 250 mL 锥形瓶中。用本法测定，结果为 0.48g/L（n=3）；另 取部分该土壤样品 ，用固相萃取HCLP 法进行测定 ，结果为0.51g/L。两结果基本吻合。 F重现性 F 每次测定时更换叶绿体膜片，分别对0.05mg/L敌草隆进 行测定（n11），得RSD 5.4。重现性与溶液、温 度等测定条件有关，为保证测量的精确度，还应使用大 小相同的PVA-SbQ膜。结论 实验利用除草剂对叶绿体膜中束缚酶催化 H2O2分解产生氧的反应的抑制作用，提出测定 痕量除草剂的方法。该法灵敏、简便、快速， 可用来测定样品中的除草剂残留量。同时，对 PVA-SbQ固定叶绿体膜的研究表明，该固定法 能最大程度地保持叶绿体膜中H2O2抗胁迫酶的 活性，并且保存寿命长，使用方便。 ReferencesThank you
