《麻醉药对大鼠海马锥体神经元钠通道电流的影响及其机制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《麻醉药对大鼠海马锥体神经元钠通道电流的影响及其机制（50页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国医科大学博士学位论文麻醉药对大鼠海马锥体神经元钠通道电流的影响及其机制姓名：何绍明申请学位级别：博士专业：麻醉学指导教师：曾因明2002.7.1麻醉药对大鼠海马锥体神经元钠通道电流的影响及其机制孛文摘要弼蟊全麻原理楚麻醉学最重癸的基本理论之一，德全麻药俸蕉的确切棱I 镅楚今不明。一般认为吸入全麻药的作用机制较为复杂，其中可能包涵静脉全麻药的作最视翱。不管吸入全麻药宏鬣秘徽蕊承平的作震部位如衙，现在可以肯定分子水平的作用部位是在神经细胞膜。越来越多的证据表明吸入麻醉药发挥效应的部位是缫臆膜上的离子逶道。在诸多的离子通道中，麻醉药对1 3 一乙酰胆碱受体( n A C h R ) 和r 一氨基
2、丁酸度受体( G A B A 。歉) 通遘影嚷的研究最多，因实验条件翻药物裁量簿嚣 索不同，研究结果不一。一般认为n A C h R 通道不是全麻药作用的主要靶位。尽管G A B A 。受体透道燕丈家公认豹全麻药主要靶位之一，在其蕊臻麻醉浓度主要增强G A B A 对该受体通道的效应，但融发现许多用对该通道作鲻不能解释的现象，敬全麻药对其它兴奋性离子遥道的作蔫邑受蓟鬟视。在中枢神经系统( C N S ) 主要的兴奋性离子通道中，钠通道为主要的兴奋性电压 - 】控登离子通道，是可兴奋缨魏产生动作电彼及传释神经摔凌的关键部位和决定因索，虽以前的实验发现枪乌贼巨轴突模型的钠通道对全麻药不敏感，僵磊聚
3、的研究证臻l 瓶床浓度的全麻药对鬣脑钠遵遂、肺泡l l 登缅胞钠通道及心肌细胞钠通道都有显著的抑制作用，且遵循M e y e r O v e r t o n规则。因茈，全麻药对脑钠通道的影响以及此影响在全麻串的地位值得研究。本课题分三部分研究异丙酚( 静脉麻酩药) 、异氟醚( 吸人麻醉药) 和利多卡因( 局部麻醉药) 对急健分离的C N S 铺通道的影响。第一部分异丙酚对大鼠海马锥体神经元钠通道电流的影响材料和方法选用1 0 1 4 dS D 大鼠，雌雄不拘，体重2 0 3 0 9 ，由徐州医学院实验动物中心提供。将实验大鼠快速断头，置于0 4 氧饱和的人工脑脊液( A C S F ) 中分离
4、出海马，手工切成约5 0 0 1 山m 厚的脑片。将脑片放人孵育槽中用A C S F 漂浮孵育6 0 r a i n ，连续通以9 5 O ：+ 5 C O ：维持p H 在7 3 5 7 4 0 。采用二步酶消化法，分别用1 0m L 的A C S F 配成0 0 5 的T r y p s i n 和0 0 5 的P r o n a s e ，相继在孵育槽内酶解( 3 2 E ，各3 0m i n ) 。酶解后的脑片 冲洗2 次后继续用A C S F 孵育。实验时每次取1 片脑片放入盛有A C S F 约1m L 的小玻璃杯中，先后用尖端热处理的直径为4 0 0 i x m 和1 5 0 斗
5、m 左右的 P a s t e u r 吸管轻轻吹打，经4 0 0 目钢网过滤到细胞灌流槽内，放在倒置显微镜上静置1 5 2 0 m i n 让细胞贴壁，用细胞外液灌洗3 次后作全细胞膜片钳记录。在显微镜下选择合适的锥体神经元作为实验对象，用硬质有芯玻璃毛坯管二步拉制记录电极，用微电极操纵器将电极缓慢推向细胞，当电极尖端贴住细胞膜后轻轻吸引使之封接，当封接阻抗大于l G Q 时，负压破膜，补偿电容电流和串联阻抗形成全细胞状态。用E P C 一9 膜片钳放大器在室温( 2 4 2 6 ) 下记录钠电流，电刺激脉冲的输出及电信号的采入均通过计算机由商用软件P u l s e8 0 2 来完成，经数
6、字化处理后贮存于计算机硬盘。实验分为7 组，异丙酚( p r o p o f o l ，P r o ) 按加入在细胞外液中的浓度( 1 0 、3 0 、5 0 、1 0 0 p 。m o l L ) 对应分为P 1 0 l o 组、P r 0 3 0 组、P r 0 5 0 组和P r 0 1 组，脂肪乳剂( i n t r a l i p i d ，I L l ) ) 按P r 0 5 0 组和P r o i 0 0 组同样的浓度对应为I L 组和I L P 。0 0 组，对照组灌流给药时仍用细胞外液。每组6 个细胞，分别记录给药前、给药后2r n i n 及冲洗后2r a i n 的钠通道
7、电流变化。抑制程度以最大内向电流的减少来计算，用与基础对照值的百分比表示。2 结果对照组、I 珊岛组和l i p 。组的峰钠电流下降率分别为4 2 3 2 、5 74 6 和4 3 3 1 ，差别无显著性意义( P 0 0 5 ) ；异丙酚抑制峰钠电流的程度与浓度呈正相关( r = 0 9 9 3 ，P 0 0 5 ) ；P r o p o f o ls h o w e dac o n c e n t r a t i o n r e l a t i v ee f f e c to nt h ep e a ks o d i u mc u r r e n ts u p p r e s s i o
8、n ( r = 0 9 9 3 ，P 0 0 5 ) ；异丙酚抑制峰钠电流的程度与浓度呈正相关( r = 0 9 9 3 ，P 0 0 5 ) ，是否反映药物使通道的变化以及在整体条件下是否有实际意义还有待于进一步研究。2 异丙酚的药理作用与其溶剂的关系异丙酚是一种脂溶性的药物，有实验报道溶解异丙酚的脂肪乳剂对心肌细胞的收缩功能有一定的影响汹 。为了排除脂肪乳剂可能对钠电流产生的影响，我们设立了与P w ，。组和P r o 。组对应浓度的I L 组和I L P 。组，结果证实脂肪乳剂对钠通道电流元明显影响，P w s o 组和P r o ，组分别抑制峰 钠电流达6 7 2 1 6 1 和8 5
9、 1 1 4 9 ，而对应浓度的I 凹卯组和耻t 组的峰钠电流仅下降5 7 4 6 和4 3 士3 1 ，相当于空白对照组峰钠电流下降的程度( 4 2 3 2 ) 。表明异丙酚对海马神经元钠电流的抑制是其2 1 自身的药理作用所致。3 异丙酚抑制钠通道的临床意义我们在H P 一1 0 0m V 时测得异丙酚对峰钠电流的抑制呈剂量相关性( r= 0 9 9 3 ，P 0 0 1 ) ，I C 5 0 为3 2 5 斗m o l L ，与R e h b e r gB m 等报道的结果相 似。他们还发现异丙酚对峰钠电流的抑制有电压依赖性，在H P 一6 0m V 的阈值膜电位和一1 2 0m V 的
10、钠通道失活电位时测得的I C 分别为1 0 9 。m o l L和2 5 “m o l L ，提示急性分离细胞和人工表达细胞的A 一1 型钠通道在同 等H P 条件下5 0 的峰钠电流抑制浓度( I C 5 0 ) 相近，与I s o mL L 瞄3 等报道的p ，亚单位不影响药物的I C 棚吻合，表明急性分离的海马锥体细胞和人工 表达的A 一1 型细胞都可作为研究脑钠通道的模型。异丙酚使5 0 的病人对切皮刺激无反应的全血浓度为8 5 m o l L 1 ，按9 8 的血浆蛋白结合 率和0 7 8 的血浆与全血比率计算瞄o ，皿浆中游离异丙酚的浓度为1 3 斗m o l L ，故阈电位时的I
11、 C ( 1 0 1 上m o l L ) 约为临床麻醉血浆浓度的8 倍。 由于静脉麻醉药的血浆浓度与脑中效应部位的浓度不一定相同，据报道异丙酚的脑血浆分配系数约为8 j ，因此脑内实际浓度大约是血浆浓度的8倍】。根据上述推算，异丙酚抑制海马锥体神经元钠通道电流的I C ，。与临床麻醉脑中浓度相似，提示钠通道电流的抑制在异丙酚的麻醉中起一定的作用。2 2 异氟醚对大鼠海马锥体神经元钠通道电流的影响前言异氟醚是目前临床上最常用的比较理想的吸入麻醉药，也是研究吸人麻醉药作用机制时最常用的药物之一。异氟醚与安氟醚为同分异构体，两者理化性质基本相同，但麻醉效价不同；空间立体构象不同的S ( + ) 和
12、R( 一) 异氟醚麻醉效价也不一，提示麻醉作用可能存在特定的分子靶位。我们首选异氟醚作为吸人麻醉药的代表药。材料和方法除实验用药不同外，材料和方法与第一部分完全相同。I s o f l u r a n e ( 批号X 9 9 0 1 3 2 ) R h 6 n e p o u l e n e 公司异氟醚( I s o f l u r a n e ，I s o ) 溶液的配备与用法：用微量加样器将定量的异氟醚注入盛有3 0m L 细胞外液的5 0m L 玻璃注射器中，注射器针芯和针筒之间涂有7 5 0 1 高真空硅脂以防漏气，注射器乳头接一金属三通密闭，注药后使劲摇晃2m i n ，然后放在振荡
13、水槽内振动1h 以上以达平衡。在注射器三通与通向灌流槽的灌流细胞外液的三通之间用美国产P P C 材料的压力监测管( O 0 8 i n 1 5 0 c m ) 连接，当记录到用药前钠电流后，打开注射器三通用T e r u m oT E 一31 2 注射泵灌流异氟醚溶液3 次并记录用药后2r a i n 的钠电流，再用细胞外液灌流3 次记录洗脱后2r a i n 的钠电流。本部分实验分为3 组，对照组、异氟醚1 0m m o l L 组，I s o L 。) 和2 0m m o l L 组( I s 0 2o ) o2 3 结果在钳制电位( H P ) 一1 0 0m V ，从一7 0m V
14、起给予以1 0m V 步幅递增的去极化c a 玉, 刺激至+ 8 0m V ，激活一系列钠电流，用I g o r 软件打印的钠电流见图2 1 ，用比基础值减少的百分率表示的抑制程度见图2 2 ，全部实验结果见表2 。I s o 。o 组和I s 0 2o 组分别抑制峰钠电流4 1 84 - 1 0 8 和6 0 74 - 1 1 3 ，表现为浓度依赖性，这两浓度组用药前后比较以及分别与对照组比较， 差别都有非常显著性意义( P O 0 1 ) 。表2 异氟醚对海马锥体神经元钠通道电流( I N ) 的影响( i - I - s ，n = 6 )与用药前比较，一P ( 0 0 1 ；与对照组比较
15、- p ( 0 O l 。讨论我们的实验证明异氟醚对大鼠海马锥体神经元钠通道电流有显著的浓度依赖性抑制，与R e h b e r gB 刮等用人工表达的钠通道的研究结果一致。他们还发现挥发性全麻药对钠通道的抑制呈电位依赖性麻醉强度和应用依赖性阻滞，在l i P 为一1 2 0 m V 时对峰钠电流抑制的I C 比临床麻醉浓度平 均高3 倍，而l i P 在一6 0m V ( 接近静息膜电位和神经元激活电位) 时的I c 值与临床麻醉浓度相似。我们在H P 为一l O O m V 时记录的异氟醚对急性分离的大鼠海马锥体神经元峰钠电流的抑制程度与R e h b e r gB 等4 报道的相 近。支
16、持C N S 钠通道可能是吸入全麻药作用的分子靶位之一的观点。R e -h b e r gB 等实验结果显示挥发性全麻药对钠通道电流抑制的机制至少是： 非电位依赖性抑制静息的或开放的钠通道；使钠通道稳态失活瞳线向超级化方向移动导致电位依赖性抑制。因时间关系，我们没有在急性分离的锥体神经元上重复这些实验。2 4 利多卡因对大鼠海马锥体神经元钠通道电流的影响前言利多卡因是临床上常用局部麻醉药的代表药。目前的研究证明钠通道理亚单位的D 。一S 。区是其作用的分子靶位冽，那么它对脑钠通道的影响如何? 我们对此进行了研究。材料和方法除实验用药不同外，材料和方法与第一部分完全相同。L i d o c a i n e ( 批号0 0 0 5 0 9 ) 上海复星朝晖制药厂。利多卡因( L i d o c
