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1、 实验5 质粒DNA的提取质粒的概念 质粒：质粒是细菌染色体外的遗传物质，大小 在1200kb之间，大多是具有双股闭合环状结构 的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于细胞浆中 。质粒提取目的 PCR的模板 质粒作为克隆载体 (研究目的基因时，常需要提取质粒)质粒提取的方法与原理 碱裂解法 SDS裂解法 煮沸裂解法 氯化铯-溴化乙锭梯度离心法 试剂盒法5碱裂解法溶液1 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。 溶液2 0.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)：60mL的5mol/L KAc,11.5ml
2、冰醋酸，28.5mL H2O61. 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37培养1216小时;2. 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液13. 充分混匀放置3-5分钟;4. 加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（变性液），加盖颠倒3-5次使之混匀，冰上放置5min;质粒小量提取的方法（手工提取）：74. 加入150 l乙酸钾溶液(溶液III)，加盖后颠倒3 -5次混匀，冰上放置5min;5. 用台式高速离心机，12000r/min离心15min， 上清移入
3、另一干净离心管，并加2倍 100乙醇 混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;6. 沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次， 12000r/min 离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上 ，除尽乙醇，室温自然干燥;7. 加入30-50l含有20g/ml RNase的灭菌蒸馏水 或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min ，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);8. 将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。8注意： 用移液器操作时，每一步都要格 外小心，特别是在加入溶液II 和 III后，一定不要剧烈振荡，以免 切碎DNA(包括质粒DNA和基因组 DNA)！质粒小抽试剂
4、盒 原理：把硅胶薄膜的优点与经典的碱-SDS裂 解细菌细胞法结合起来。 优点：操作简便、节约时间、性/价比高。使用者需备 10,000xg以上高速离心机 1.5ml的灭菌干净小离心管 灭菌去离子水(或TE缓冲液) 无水乙醇 注意 一、使用前往准备好的SolutionI中加入RNase A， 二、浓缩的Wash Buffer需用乙醇稀释：三、稀释后的DNA Wash Buffer需室温保存；四、所有步骤必须在室温下操作。 实验操作步骤 增殖细菌、扩增质粒 裂解菌体、获取质粒 抽提质粒、分离纯化 结果鉴定对于未经酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带1）（松弛）螺旋状质粒DNA带 2）超螺旋状质粒DN
5、A的带以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时 还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA 在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介 于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间。如果提取的质 粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。质粒DNA提取范例： 质粒DNA的酶切鉴定1. 实验目的和要求学习和掌握限制性内切酶的特性、酶 解操作方法，并理解限制性内切酶是 DNA重组技术的关键工具。 2. 相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双 链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工 具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶 以及末端修饰酶等一起称为工具酶。 限制性核酸内切酶不仅
6、是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组 酶切图谱的鉴定。1)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同，分为三类：型型*型II型 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的 固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶 的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这 种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工 具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常 见的是4个或6个核苷酸II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文 对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝 二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链
7、末端，这种末 端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末 端。如EcoRI的识别顺序为：5 GAA|TT_C 33 C_TT|AAG 5垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是 GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和 表示在双链上交错切割的位置 II型酶切割方式的另一种是在同一位置 上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接 起来。平头末端：2) 影响核酸限制性内切酶活性的因素(1) DNA的纯度；(2) DNA的甲基化程度；(3) 酶切消化反应的
8、温度；(4) DNA的分子结构；(5) 溶液中离子浓度及种类；(6) 缓冲液的 pH值。3. 实验材料与仪器 质粒 标准分子量片段( DNA Ladder) EcoRI 和 Hind 核酸内切酶（Takara） EcoRI和 Hind 酶解缓冲液(10M buffer) 琼脂糖 TBE或TAE缓冲液(10) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上样液(6)：0.25% 溴酚兰，40(W/V)蔗 糖 水溶液 。缓冲液因为不同的酶所要求的最适反应条件不 同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。 一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。 双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题， 一般公司会给用户提供这方面的信息。EcoR I 酶切位点：GAATTCHind 酶切位点： AAGGCT质粒量（ng）缓冲液 (l)*EcoR1 （l）Hind （l）总体积（l）200(5l)10.50.510* 缓冲液随不同的酶而不同,本实验用 M buffer。置于37水浴酶解0.5-1小时。酶解完成后，分别 加入3l的上样缓冲液, 然后进行电泳分析。1) 质粒DNA的酶解 4. 实验方法和步骤 实验结果 12 3 M 1 2 3 M 1 2 3 1. 未酶切质粒；2. EcoRI 单酶切；3. EcoR1+Hind 双酶 切 M. DNA Marker.
