课题3_血红蛋白的提取与分离自制

《课题3_血红蛋白的提取与分离自制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《课题3_血红蛋白的提取与分离自制（74页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、 ( (一）蛋白质一）蛋白质占细胞干重的占细胞干重的5050以上，细胞中含量最多的以上，细胞中含量最多的 有机物有机物2 2、组成元素、组成元素C C、HH、OO、N N一、基础知识一、基础知识1 1、含量、含量3 3、相对分子质量、相对分子质量高分子化合物高分子化合物4 4、基本组成单位、基本组成单位氨基酸氨基酸5 5、氨基酸通式、氨基酸通式R RHHC CCOOHCOOHNHNH2 26 6、氨基酸连接方式、氨基酸连接方式脱水缩合脱水缩合写出氨基酸脱水缩合形成二肽 示意图氨基酸的结合方式CHCOOHR1CHNH2COOHR2NH2COHNHOH氨基酸的结合方式CHR1NH2OHCOH2OC

2、HCOOHR2HNH氨基酸的结合方式:CHR1NH2COCHCOOHR2HNH2O二 肽肽键脱水缩合氨基酸的结合方式:脱水缩合肽键CHCOOHR3HNOH HCCHR1NH2COCHR2HNO二肽H2OH2O氨基酸的结合方式:脱水缩合CCHR1NH2COCHR2HNO肽键二肽CHCOOHR3HNH2O肽键三 肽 以此类推，由多个氨基酸分子缩合而成的含有多个 肽键的化合物，叫多肽（链状）。肽链盘曲，折叠 ，形成有一定空间结构的蛋白质分子。H2O8 8、分子结构、分子结构7 7、肽键、肽键COCONHNH氨基酸氨基酸肽链肽链蛋白质蛋白质脱水缩合脱水缩合盘曲折叠盘曲折叠（一条或者多条）（一条或者多条

3、）1010、生理功能、生理功能细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组 织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫 、催化等作用，是一切生命活动的主要承担、催化等作用，是一切生命活动的主要承担 者者氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺 序变化多端；多肽链的空间结构千差万别序变化多端；多肽链的空间结构千差万别9 9、蛋白质结构的多样性、蛋白质结构的多样性氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不 存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨存在了，形成

4、的化合物即多肽的一端只有一个氨 基，另一端只有一个羧基（不计基，另一端只有一个羧基（不计R R基上的氨基和基上的氨基和 羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨 基和羧基都是一个基和羧基都是一个若有个若有个n n氨基酸分子缩和成氨基酸分子缩和成mm条肽链条肽链, ,则可形成则可形成 _个肽键个肽键, ,脱去脱去_个水分子，至有氨基个水分子，至有氨基 和和 羧基各羧基各 _个个1111、相关计算、相关计算n - mn - mn - mn - m mm蛋白质可以含有一条或蛋白质可以含有一条或n n条肽链、肽链通过化条肽链、肽链通过化 学键（如二硫键）互相

5、连接，具有不同的空间结学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结 构构关于蛋白质相对分子量的计算：关于蛋白质相对分子量的计算： n n 个氨基酸形个氨基酸形 成成mm条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,a,那么那么 由此形成的蛋白质的相对分子量为由此形成的蛋白质的相对分子量为_n n a - (n - m) a - (n - m) 1818思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有 不同物理或化学性质的生物大分子。思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异 分子的形状和大小所带电荷的性质和多少溶解度分离不

6、同蛋白质思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质 的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构思考4 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便 于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞 核，结构简单，血红蛋白含量丰富便 于提取血红蛋白。一、凝胶色谱法原理一些微小多孔的球体内含许多贯穿的通道， 由多糖类化合物构成的如葡聚糖、琼脂糖， 具多孔的凝胶就叫分子筛什么是凝胶？原理：当不同的蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部的通道容易进入无法进入凝胶 内部的通道 只能在凝胶外部移动路程较长 移动速度较慢路程较短 移动

7、速度较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。缓冲溶液的配制调节缓冲剂的（ ）就可以 制得（ ）使用的 缓冲液。12使用比例 在不同PH范围内通常由（ ）种缓冲剂溶解 于水中配制而成。(1)0.2 mol/L的Na2HPO4溶液 将71.64 g的Na2HPO412H2O溶解在1 000 mL 的蒸馏水中 (2)0.2 mol/L的NaH2PO4溶液 将31.21 g的NaH2PO42H2O溶解在1 000 mL 的蒸馏水中 pHpH5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.88.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.092.0 87.7 81.5 73.5 62.5 51.07

8、.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.061.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.739.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.30.2 mol/LNaH2PO4/mL0.2 mol/LNa2HPO4/mL0.2 mol/L 0.2 mol/LNaH2PO4/mLNa2HPO4/mL思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲 液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲 液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白 的正常结构和功能，便于观察（红色） 和材料的科学研究（活性）二、电泳的原理概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。待分 离样 品中 各种 分子带电性

9、质的差异大小、形状的不同带电分子产生不 同的迁移速度1、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 等因素。分子的大小它所带静电荷的多少以及分子的大小2、SDS：十二烷基硫酸钠 为了消除静电荷对迁移率的影响SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物 ，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子 原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的 电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( )。电泳检测PCR结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳课堂小结：1、凝胶色谱法原理： 当不同的蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部的通道容易进入无法进入凝胶 内部的通道 只能在凝胶外部移动路程较长 移动速度较慢路程较短

10、 移动速度较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。待分 离样 品中 各种 分子带电性质的差异大小、形状的不同带电分子产生不 同的迁移速度2、凝胶电泳原理二 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理和粗分离血 液血浆水分固体物质血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等血细胞白细胞 血小板 红细胞 （最多）血红 蛋白 （ ）两个a肽链两个一肽链样品处理和粗分离纯化纯度鉴定共四条肽链90亚铁血红素集团 1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要 加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分 层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水 洗涤。 2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用 下，红细胞破裂释放磁力搅

11、拌器搅拌器转子搅拌器正在工作 3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸 过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出 红色透明液体。第1层（最上层）：（ ）甲苯层 第2层（中上层）：（ ）的沉淀层，（ ）色薄层固体第3层（中下层）：（ ）的水溶液层（ ）的液体第4层（最下层）：其它杂质（ ）的沉淀层无色透明脂溶性物质 白血红蛋白 红色透明暗红色用滤纸过滤， 除去红细胞破 碎物沉淀，于 分液漏斗中静 置片刻后，分 出下层的红色 透明液体。 4、透析：装入透析袋并置 于磷酸缓冲液中（PH为7.0） 透析。利用透析袋透析二、凝胶色谱纯化2.凝胶色谱制作 1）凝胶色谱柱的制作 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃 管

12、，两端需用砂纸磨平。底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管 头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包 好。2）凝胶色谱柱填料的处理 （1）凝胶的选择： （ ）（G-75）“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 （2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量 的凝胶浸泡于（ ）中充分溶胀后 ，配成（ ）。蒸馏水 凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶固定：将色谱柱处置固定在支架上装填：将（ ）一次性的缓慢 倒入（ ）内，装填时轻轻敲动色 谱柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液 色谱柱洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( )

13、 高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲 液（pH为7.0）充分（ ）12小时。洗涤平衡50cm3）样品加入与洗脱加样前打开下端出口，使柱内凝 胶面上的（ ）缓慢下 降到与（ ）平齐， 关闭出口缓冲液 凝胶面加透析样品注意正确的加样操作：不要触及破坏凝胶面 贴壁加样使吸管管口沿管壁环绕移动调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用（ ）将1ml（ ） 的样品加到色谱柱的（ ）样品渗入凝胶床：（ ）洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱收集：待（ ）接近色谱柱底 端时，用试管收集流出液，每（ ） 收集一试管连续收集吸管透析液 顶端样品完全进凝胶层5ml红色的蛋白质开始进行层析收集得到的

14、纯化后的蛋白实验录像血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱 分离时可以通过观察颜色来判断什么时 候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分 离过程非常直观，大大简化了实验操作 。 思考血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步， 包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定 。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、 离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的 处理；再经过透析去除分子量较小的杂质， 即（ ）；然后通过凝胶色谱 法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样 品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳 进行（ ）。思考样品的粗分离纯化 纯度鉴定三、纯度鉴定3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（ ）的蛋白质是否达到要求 ，需要进

15、行蛋白质的鉴定。纯化实验录像观察你处理的血液样品离心后是否分层 （见教科书图5-18），如果分层不明显 ，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋 白的原因。此外，离心速度过高和时间 过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀 ，也得不到纯净的红细胞，影响后续血 红蛋白的提取纯度。三 实验结果分析与评价注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶 颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气 泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质 的洗脱次序，降低分离效果。 洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面，否 则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流 动与最终生物大分子物质的分离效果。不 能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象 ，否则重新填装。 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝 胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝 胶是否装填得