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1、 第十三章紫外-可见分光光度法分光光度法(spectrophotometry)：根据物质的吸 收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性、定量 分析的一种分析方法。 第一节分光光度法的基本原理一、物质对光的选择性吸收 1、电磁辐射光E= h= hc/单色光：单一波长的光称为单色光，复色光：由不同波长组成的光称为复色光。 光红橙黄绿青兰紫波 长780 - 620620 - 590590 - 560560 - 500500 - 480480 - 430430 - 380光的互补性：若两种颜色的光按适当的强度比 混合可得白光，则这两种光称为互补色光。 2、物质对光的选择性吸收M(基态)+h M*(激发态)
2、 E=E（激发态）-E（基态）= h只有当光子的能量(h)与被照射物质粒子的基 态和激发态能量之差(E)相等时，才能被吸收。处于同一直线上的两种 色光为互补光。如蓝光与黄光互补，青 光与红光互补等。 二、物质的吸收光谱 吸收光谱：溶液对对不同 波长长的光的吸收程度不 同，以吸收程度（吸光 度）为纵为纵 坐标标，以波长长 为为横坐标标作图图，所得曲 线线，即为为吸收光谱或称 吸收曲线。最大吸收波长 ：吸收光 谱中，吸光度最大处的 波长为最大吸收波长， 用max表示。三、透光率和吸光度I0IaItI0 = Ia + It透光率的取值范围：0 - 100%T越大，溶液对光的吸收程度越小。吸光度的取值
3、范围：0 + A愈大，溶液对光的吸收愈多。 四、Lambert-Beer定律 A=b c A：吸光度， b：吸收池厚度，单位，cm。 c：物质的量浓度（mol.L-1）：摩尔吸光系数，单位：L.mol-1.cm-1例 已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合 物用乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmolL-1的溶液， 在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为 39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数 。解 由Lambert-Beer定律可得：说明1：Lambert-Beer定律只适用于单色光。 说明2：吸光度具有加和性。 A A1+ A2 + A3 + 例12-2 测试酶与
4、腺苷酸(AMP)体系的吸光度如下 ： A(280nm)=0.46， A(260nm)=0.58，试计算每一组 分的浓度。已知吸收池厚度为1.00cm。 酶(280nm)=2.96104L.mol-1.cm-1 (260nm)= 1.52 104L.mol-1.cm-1 AMP (280nm) = 2.4 103L.mol-1.cm-1 (260nm) = 1.5 104L.mol-1.cm-1解 设酶和AMP的浓度分别为y和z 为260nm0.58 1.521041.00y+1.51041.00z为280nm0.462.961041.00y+2.41031.00z解方程得：y 1.410-5m
5、olL1 z 2.510-5 molL-1答： 酶的浓度为1.410-5molL1AMP的浓度为2.510-5molL-1 。 第二节 紫外-可见分光光度法一、分光光度计光源 单色器 吸收池 讯号处理及显示器 1、光源：钨灯，可发出3203 200nm的连续光谱， 最适宜的波长范围为3601 000nm。2、单色光器(monochromatro)3、吸收池：厚度有0.5、1.0、2.0、3.0、5.0cm 等规格。4、检测器：可见分光光度计用光电管、放大器、 指示器。指示器一般有微安电表，记录器，数字 显示和打印等。二、测定方法（一）标准曲线法配成一系列已知浓度的标准溶液，在选定的波 长处用同样厚度的吸收池分别测其吸光度，以吸 光度为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标作图， 可得一通过原点的直线，即为标准曲线。（二）标准对照法用标准品配制一个已知浓度的标准溶液，在选 定的波长处用同样厚度的吸收池分别测定标准溶 液和未知溶液的吸光度，用计算公式求出未知溶 液的浓度。1、溶剂空白除被测物外无其它有色物质干扰时，可用溶剂 作空白溶液。 2. 试剂空白 按显色反应相同的条件加入各种试剂和溶剂( 不加试样溶液)后所得溶液。 3. 试样空白 不加显色剂但按显色反应相同条件进行操作的 试样溶液。
