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1、PCR 扩增产物的分析 Gel electrophoresis Restriction endonuclease Molecular hybridization Nucleic acid sequencePCR扩增产物的电泳分析琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测（定性）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中可用于科研及检测分析琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常 用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和 低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37 下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段
2、 的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等凝胶浓度选择琼琼脂糖浓浓度(%)线线型DNA分子的分离范围围(Kb) 0.3560 0.6120 0.70.810 0.90.57 1.20.96 1.50.23 12.00.12琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围电泳缓冲液 常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果 好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓 度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而 推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合 二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防 止PC
3、R扩增产物降解10TBE缓冲液的配制 配方 Tris 108克 EDTA 9.3克 硼酸 55克 H2O至 1000ml pH应为8.08.2 临用时用水稀至0.5TBE（20倍稀释 ）核酸电泳的指示剂 指示剂： 溴酚兰 二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色 电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA 片段琼琼脂糖凝 胶浓浓度0.6%1%1.4%2%迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb核酸电泳的指示剂 二甲苯青：水溶液呈兰色， 电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大 致相当琼琼脂糖凝胶浓浓度1%1.4% 迁移率2Kb1.6Kb载样缓冲液 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400组成载样缓冲液
4、 作用： 增加样品密度，使其比重增加，以 确保DNA均匀沉入加样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色，使加样操作更方便核酸电泳的染色剂 最常用的染色剂 溴化乙锭 银染色核酸电泳的染色剂 溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱 基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB， 有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中 染色1015min 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其 DNA量一般5ng 溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不 清时，可将凝
5、胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察核酸电泳的染色剂 银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与核 酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色 黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于 琼脂糖凝胶染色 灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不 宜回收电泳 电泳装置 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等电泳仪 普通电泳仪 高压电泳仪电泳槽 水平平板 垂直平板电泳方法 用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在 水平桌面上，并架好梳子 根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼 脂糖凝胶，一般 200400 bp 的DNA片段 （可配制1.21.7%）电泳方法 配制琼脂糖凝胶
6、及倒胶 0.5TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微 波炉内加热熔化，冷却至60(需要时可加 入EB)，倒入电泳槽中，待凝固 向电泳槽中倒入0.5 TBE，其量以没过胶 面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去）电泳方法 上样与通电 在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混 匀后，加入样品孔内 接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切 记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔 的一端为负），电压为1 5V/cm（长度以 两个电极之间的距离计算） 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 ，一般 200400bp 的PCR产物50V电压，电 泳2
7、040min电泳方法 结果观察 紫外仪上观察电泳带及其位置 并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小聚丙烯酰胺凝胶电泳 适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的 DNA片段和DNA序列分析 其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长 度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分离聚丙烯酰胺凝胶 由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N， N，N，N一四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯 酰胺链在交联剂，N，N一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而 形成凝胶 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺 的浓度决定的不同浓度丙烯酰胺和DNA有效分离范围 丙
8、烯酰烯酰 胺 （%）有效分离范围围 （bp）溴酚兰兰*二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0604004516012.040200307015.025150156020.0101001245材料 电泳仪器： 电泳仪 垂直电泳槽及其附件. 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，29克 N，N一亚甲基双丙烯酰胺，1克 H2O，加至100ml 装于棕色瓶内，4可保存二个月材料 10%过硫酸铵 过硫酰铵，1克，加水至 10 ml 4可保存一周，-20可保存一个月 1TBE电泳缓冲液 TEMED（四甲基乙烯基二胺）聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 配胶：根据分离DNA片段的大小及需凝胶
9、 的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶 按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两 侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不 严而使聚丙烯酰胺液漏出 将装好的玻璃电泳板倾斜成4560角 按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数 加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻 璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿 下产生气泡，用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将 玻璃板斜靠在物体上，使成10角，可减少液体泄漏的机会 室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽 中，上紧，倒入0.1TBE缓冲液聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，
10、 因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部 未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产 生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则 将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳 电泳毕，切断电源，取出胶床板，小心移去 一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上 ，浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，15 30min后取出水洗，紫外仪下观察结果 聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量 的DNA条带（要求更高的灵敏度，可用银染）电泳结果分析 DNA Marker DNA 人工片段 100 bp ladde
11、r酶切分析 根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶进行酶切 酶切产物电泳分离后，获得符合理论的 片段 此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基 因分型，还能进行变异性研究分子杂交 检测PCR产物特异性的有力证据 检测PCR 产物碱基突变的有效方法 主要的杂交 Southern印迹杂交 斑点杂交Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链 并作标记（探针） 与 PCR 产物杂交 此法既可作特异性鉴定，又可以提高 检测 PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。斑点杂交： 将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上 寡核苷酸探针杂交 观察有无着色斑点 主要用于
12、 PCR产物特异性鉴定及变异分析RDB检测 -地中海贫血突变基因-29（AG）-28（ AG）17（ AT，AAG TAG ）E （CD26 GAG AAG）IVS-I-1（ GT ）IVS-I-5（ GC）27-28（+C）41-42（-CTTT）43（ GT ）71-72（+A或+T）654（ CT）微孔板夹心杂交法 通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物 的某一区域特异性杂交，使PCR产物间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非 放射性标记物标记的检测探针与产物的另一 区域特异性杂交，漂洗后显色即可判断结果 该法使用了两个杂交过程来检测一个产物， 其特异性较一次杂交的检测法高Pri
13、nciplePrinciple：NOS（11014/cm2）N-羟化琥珀酰亚胺酯PrinciplePrinciple-CCCCCCCapture Probe:：NH2Detection Probe:：BiotinPrinciplePrinciple：NH2标记的探针：Biotin标记的探针Avidin-HRP 显色系统：NOS基团PrinciplePrinciple微孔板夹心杂交法方法学评价 敏感度：该法检测HBV，敏感度达5个HBV DNA分子 敏感性和特异性与 PCR 32P 探针的Southern杂交法相当 PCR微孔板夹心杂交法：操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类
14、似于临床常规应用的ELISA微孔板直接杂交 不是采用夹心法，而是直接将特异的探 针固定于微孔板上，然后用生物素标记 的PCR产物与之杂交 只进行一次杂交，方法简单，但特异性 不高微孔板杂交的基本过程 DNA的固定 探针的杂交 酶联显色DNA的固定 在一定盐浓度条件下，DNA单链的一端可固定在微孔板上 不同来源的微孔板固定DNA时所需盐浓度不同。因此，必须用一系列的盐浓度 （0.153.0mol/L NaCl）来固定加热变性的核酸，然后，用固定浓度的标记探针杂 交。显色后，判断合适的固定盐浓度DNA的固定 固定方法的选择必须使DNA最大量的固定，且不影响杂交 用合适浓度的 NaCl 或（NH4）
15、2SO4 可达到此目的。硫氰酸钠则无固定作用。 盐浓度合适时，DNA应为一端固定到微孔 板上，而太低或太高浓度的盐可能使DNA “ 平躺”固定在孔内而影响杂交DNA的固定 Mg2+虽有促进DNA固定的作用，但它可 激活Dnase，所以，一般不用 被固定的DNA应大于300bp，否则影响 杂交结果。每孔可固定高达 200ng（ 624bp）的DNA 盐浓度和固定量确定后，按下法固定 DNADNA的固定 待固定DNA 100加热 5min 变性，并立 即冷却，与合适的固定液混合后，加入微 孔板的孔内 固定液：10mmol/L磷酸钠-10mmol/L EDTA ，pH7.0，合适浓度的NaCl（与DNA变性混合 后，终浓度为最适固定浓度） 用胶布封好，浸于37水浴2h 用PBS-0.05%Tween20 漂洗3次 立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存杂交与显色 杂交 可采用标准的杂交系统杂交 夹心杂交时，是将变性的PCR产物与检测探针一并加入 杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短 显色 根据不同酶标，检测分子的不同来选择不同的 底物、终止剂和测定波长颜色互补分析法（A） 利用三原色原理，当不同DNA片段（A和B）同时扩 增时，用引物5端修饰技术将不同引物用不同颜色荧
