《同型半胱氨酸经DDAH-ADMA-NOS-NO通路损害血管内皮细胞的NO系统》由会员分享，可在线阅读，更多相关《同型半胱氨酸经DDAH-ADMA-NOS-NO通路损害血管内皮细胞的NO系统（111页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、四川大学博士学位论文同型半胱氨酸经DDAH/ADMA/NOS/NO通路损害血管内皮细胞的 NO系统姓名：张敬各申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：王树人20070430四川大学博士学位论文英文缩写英文全称英文缩略语A b b r e v i a t i o n中文全称H y p e r h o m o c y s t e i n e m i a高同型半胱氨酸血症T o t a lH o m o c y s t e i n e总同型半胱氨酸H o m o c y s t e i n e同型半胱氨酸A t h e r o s c l e r o s i s动脉粥样硬化R e a c
2、 t i v eO x y g e nS p e c i e s活性氧N i h - i cO x i d e一氧化氮N i t r i cO x i d eS y n t h a s e一氧化氮合酶I n d u c i b l eN i l z i cO x i d eS y n t h a s e诱生型一氧化氮合酶N e u r o n a lN i t r i cO x i d eS y n t h a s e神经元型一氧化氮合酶E n d o t h e l i a lN i t r i cO x i d eS y n t h a s e内皮型一氧化氮合酶C o n s t i t
3、u t i v eN i t r i cO x i d eS y n t h a s e结构型一氧化氮合酶A s y m m e t r i cD i m e t h y l a r g i n i n e不对称二甲基精氨酸C y s t c i n e半胱氨酸D i m e t h y l a r g i n i n e二甲基精氨酸二甲氨基D i m e t h y l a m i n o h y d r o l a s e水解酶H u m a nU m b i l i c a lV e i nE n d o t h e l i a lC e l l s人脐静脉内皮细胞P r o t e i
4、 n A r g i n i n e N - m e t h y l l r a n s f e r a s e s蛋白精氨酸甲基转移酶S - a d e n o s y i h o m o c y s t e i n eS 一腺苷同型半胱氨酸S - a d e n o s y l m e t h i o n i n eS 一腺苷甲硫氨酸7 1脚岍童觞|耋|耋懈一一一一占一r一一湖 洲四川大学博士学位论文R e v e r s eT r a n s c r i p t a s eP o l y m e r a s cC h a i nR e c m i o nM e t h y l a t i
5、 o n - s p e c i f i cP C RE s 扛o g e nR c c c p t o r - i 1。1 5 - L i p o x y g e n a s ea p o l i p o p r o t e i nBm R N Ae d i t i n ge n z y m e - c a t a l y t i cp o l y p e p t i d ef a m i l ym o n o c a r b o x y l a t ct r a n s p o r t e ra c h a c e U l l l 盯I s l 巾口o x i d ed i s m u t
6、 a 舱逆转录聚合酶链反应甲基化特异性P C R雌激素受体一a1 5 一脂氧合酶载脂蛋白Bm R N A 编辑酶催化多肽家族乳酸转移酶细胞外超氧化物歧化酶一 脚 瞰 一 唧 一声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得l 盈) J I 大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。申请人：
7、彬瓠旁艏蛳：躲p ，四川大学博士学位论文同型半胱氨酸经D D A H A D M A N O S N O 通路损害血管内皮细胞的N O 系统病理学与病理生理学专业博士生张敬各导师王树人教授中文摘要目的高同型半胱氨酸血症( h y p e r h o m c c y s t e i n e m i a , H H c y ) 是一种以血浆总同型半胱氨酸( t o t a lh o m o c y s t c i n c ，t H c y ) 浓度升高为特征的病理状态，是动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，A S ) 类心血管疾病的危险因子。但迄今为止，血
8、浆H e y水平升高引起A S 的发病机制并不完全清楚。目前多数研究认为，H H c y 引起的血管内皮功能损害是A S 发生的始动环节，机制之一是内皮源性一氧化氮( n i t r i co x i d e ，N O ) 生物利用度降低。N O 是内皮细胞合成的一种重要的衄管活性物质，具有舒张血管，抑制血小板聚集，抑制白细胞粘附及平滑肌细胞增殖，减少氧自由基产生和低密度脂蛋白氧化等抗A S 的作用，因此被称为“内源性抗动脉粥样硬化因子”。N O 减少或生物利用度下降常出现内皮依赖性血管舒张功能障碍，导致血压升高和动脉硬化。目前的研究显示，H e y 可通过多种机制导致A S ，而对内皮N O
9、 系统的损伤则可能主要经氧化应激和升高血中不对称二甲基精氨酸( a s y m m e t r i cd i m e t h y l a r g i n i n e ，A D M A ) 的浓度导致。两个H e y 分子的自由巯基( - S H ) 自氧化形成二硫键时产生两个自由电子，促进活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，R O S )的生成，并氧化N O 生成过氧亚硝基阴离子( O N 0 0 。) ，O N 0 0 - 亦是一个强毒性的氧化基团。A D M A 是N O S 的内源性抑制剂，可与L 一精氨酸竞争结合N O S1四川大
10、学博士学位论文活性部位，从而减少N O 合成。A D M A 除了抑制N O 生成外，还促进e N O S 脱偶联，导致超氧阴离子及其它R O S 生成增加，R O S 水平升高可能导致内皮源性N O 的氧化失活，这反过来可能引起N O 生物利用度的进一步降低。但上述解释至今仍存在诸多疑点：半胱氨酸( c y s t e i n e , C y ) 与H c y 的分子结构极其相似，仅在碳链上少一个甲基，同样具有自由巯基，其自由巯基具有与H c y 分子的自由巯基相似的生化反应。且其血浆浓度远高- 于H C Y ，大约是H c y i 缸浆浓度的2 0 - - 3 0 倍，但半胱氨酸并不被认为
11、促进氧化应激和A S 。H c y 引起舢) M A 浓度升高亦被认为与H c y 的自由巯基有关，舢孙n 降解酶二甲基精氨酸- - q a 氨基水解酶( d i m e t h y l a r g i n i n ed i m e t h y l a m i n o h y d r o l a s e , D D A H ) 的活性中心包含一个活性必需的游离半胱氨酸残基，H c y 的半胱氨酸残基与此半胱氨酸残基形成二硫键，导致酶的失活，从而阻断A D M A 的降解，导致A D M A 堆积、血浆浓度升高。但半胱氨酸亦具有相似的分子和巯基结构，因此，仅从H c y 自由巯基活跃的氧化一还原
12、反应特性来解释其损伤效应显然有诸多牵强之处。H C Y 和半胱氨酸代谢上的一个显著差异是H c y 参与一碳单位代谢，与D N A 、蛋白质等许多物质的转甲基反应有关，半胱氨酸则无此功能。D N A 的甲基化修饰是调控基因表达的重要方式，是近年来E p i g e n e t i c s 的研究热点。H I - I c y 己被证明与许多基因的表达异常有关。因此，H e y 是否通过干扰N O S 或D D A H 基因的甲基化修饰进而影响N O 系统的功能? 目前尚未见有相关报导。本课题利用体外培养的人脐静脉血管内皮细胞( h u m a nu m b i l i c a lv e i ne
13、 n d o t h e l i a lc e l l s H U V E C ) ，通过观察不同浓度H c y 对细胞e N O S 及其通路的影响，从基因和蛋白质水平及其甲基化状态改变着手，探讨H c y 对内皮N O 系统的损伤机制，为阐明H c y 在A S 发生中的作用机制提供一全新的视角。方法利用体外培养H U V E C ，传至第三代，加入不同浓度的H C Y ( 0 , 1 0 , 3 0 ，1 0 0 ，3 0 0u M ) 和5 一氮杂脱氧胞苷( 5p M ) 后培养7 2h ，用R T - P C R 检测细胞内皮型一氧化氮合酶( e n d o t h e l i a
14、ln i u i co x i d es y n a p s e , e N O S ) 和D D A Hm R N A 水平；2四川大学博士学位论文用免疫组织化学技术估测细胞e N O S 蛋白表达水平：高效液相色谱测定细胞培养液中A D M A 浓度；并分别测定细胞D D A H 和e N O S 活性及培养液中N O 含量；用巢式甲基化特异性P C R ( n e s t e dm e t h y l a t i o n - s p e c i f i cp o l y m e m s ec h a i nr e a c t i o n , n M S P ) 检测细胞D D A H 启
15、动子区C p G 岛甲基化状态。结果H U V E C 与不同浓度H e y 培养7 2h 后，免疫组织化学染色结果显示，对照组H U V E C 内e N O S 呈阳性表达，经H e y 处理后，细胞内e N O S 表达减弱，图像分析结果显示，各组阳性细胞的积分光密度值分别为：对照组O 1 5 9 - i - 0 0 0 3 ，1 0 州组0 1 5 4 ：E 0 0 0 9 ，3 0 小组0 1 4 2 - 士o 0 1 3 ，1 0 0 州组O 1 3 6 ：0 0 1 1 ，3 0 0v - M组O 1 2 6 士- 0 0 0 8 。与对照组相比，3 0 、1 0 0 和3 0
16、0 小组有显著性差异( P 9 5 ，调整细胞密度，以2 x 1 0 5e e l l m l接种于培养瓶，3 7 ，饱和湿度，5 C 0 2 培养箱中培养，2 4h 后换液，去除未贴壁细胞，整个过程为无菌操作。5 ) 以后每隔2 3 天换液一次，待细胞长满瓶底后，0 2 5 胰酶消化，以l ：2传代，选用第三代细胞用于实验。2 1 2 人脐静脉内皮细胞的鉴定1 ) 倒置相差显微镜下进行细胞形态学观察。2 ) V I I I 因子相关抗原免疫组织化学染色鉴定：培养细胞爬片，用P B S ( p H 7 4 )冲洗三次，每次3 m i n ：在丙酮中固定1 0 m i l l ；每片加1 滴3 过氧化氢溶液，室温下孵育1 0r a i n ，以阻断内源性过氧化物酶的活性。P B S 冲洗三次，每次3 r a i n ：除去P B S 液，每片加l 滴或5 0 m 的抗V I I I 因子抗体，室温下孵育lh 或4 1 2 过夜；P B S 冲洗三次，每次5m i l l 。除去P B S 液，每片加1滴
