《超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术中空心光束的形成》由会员分享，可在线阅读，更多相关《超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术中空心光束的形成（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、物 理 学 报Ac t a P h y s S i n Vo 1 6 3 ， No 2 1( 2 0 1 4 ) 2 1 4 6 0 1 超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微成像 技术中空心光束的形成冰 刘双龙 刘伟 陈丹妮 牛憨笨十 ( 深圳大学光电工程学院， 光电子器件与系统( 教育部 广东省) 重点实验室， 深圳 5 1 8 0 6 0 ) ( 2 0 1 4 年4 月 1 0目收到； 2 0 1 4 年6 月 2 5曰收到修改稿) 空心光束的质量是超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术中决定成像质量的一个至关重要 的因素 本文基于菲涅耳衍射理论， 分析了螺旋相位片法产生空心光束的
2、物理机理， 并且模拟 了不同的入射 条件对产生的空心光束的影响 模拟结果表明：波长与相位片中心波长匹配且光强呈圆对称分布的高斯光垂 直入射到相位片上， 当高斯光束中心与相位片中心完全对准时， 可获得较理想的空心光束； 入射光光强分布的 圆对称性以及入射光中心与相位片中心的对准程度都会影响产生的空心光束 的强度分布； 同时， 高斯光束小 角度倾斜入射时， 空心光的强度分布仍呈 圆对称， 却在观察面发生一定的位移； 此外， 入射光 中心波长偏离相 位片 中心波长不大时， 对产生的空心光束的强度分布几乎没有影响上述分析结果对用于超衍射相干反斯托 克斯拉曼散射显微成像技术中理想空心光束 的获取具有重要
3、的指导意义 关键词： 空心光束， 超衍射极限， 相干反斯托克斯拉曼散射， 螺旋相位片 P ACS ： 4 6 4 0 C d ， 4 2 6 5 D r ， 4 2 6 5 一 k DO I ： 1 0 7 4 9 8 a p s 6 3 2 1 4 6 0 1 1 引 言 反映生命体性质的特征尺度都在纳米量级， 远 远超过常规光学显微镜横向约 2 0 0 a m、 轴 向约 5 0 0 n m的空 间分辨率极 限 1 】 虽然原子力 显微镜 、 电 子显微镜等 可 以实现纳米 量级 的分辨本 领， 然而 电子显微镜所 需要 的真空环境不利于生物样 品的 存 活，因而无法用于活细胞成像， 原子
4、力显微镜和 扫描隧道显微镜仅限于对样品表面成像 无法观 察细胞 的内部结构因此， 人们迫切希望拥有一种 既具有纳米尺 度 的空 间分 辨率， 又可 以监测活细 胞 内分子运动和结构变化 的显微成像 技术近些 年来， 随着新 型荧光标记物 的 出现 以及 成像方法 的改进， 荧光 显微成像技 术的分辨率得 到极大提 高， 能够达 到 1 0 2 0 n m空间分辨率， 从而使细胞 内精细结 构的观 察成为可 能， 这些荧光超 分辨 显 微成像技术包括：光敏定位显微 f p h o t o a c t i v a t e d lo c a l i z a t i o n mi c r o s c
5、o p y , P A L M) 3 、 随机光学重建 显微 f s t o c h a s t i c o p t i c a l r e c o n s t r u c t i o n mi c r o s c o p y ， S T O R M) 】 和受激发射损耗法 f s t i m u l a t e d e m i s s i o n d e p l e t i o n ， S T E D ) 等以上基于荧光标记的 超分辨显微成像技术由于荧光标记物 的引入， 不可 避免对活细胞引起毒性， 同时荧光团 自身的光致漂 白和光损伤都是无法 回避 的问题因此我们亟需 摆脱荧光方法的束缚，
6、 发展一种无需标记， 同时具 有 良好化学特异性和探测灵敏度的新型显微成像 技术 相 干 反 斯 托 克 斯 拉 曼 散 射 f c o h e r e n t a n t i S t o k e s Ra ma n s c a t t e r i n g ，C ARS 1 显 微成 像技 术 可 以在无需外援性标记的情况下， 根据物质分子的 振动或者转动特性获取待测样 品的分子 组成和分 国家重点基础研究发展计划 ( 9 7 3 计划) ( 批准号： 2 0 1 2 CB 8 2 5 8 0 2 ) 、 国家 自然科学基金 ( 批准号： 6 1 2 3 5 0 1 2 ， 6 1 1 7 8
7、 0 8 0 ， 1 1 0 0 4 1 3 6 ) ， 国家 重大科 学仪器 设备开发 专项 ( 批准 号： 2 0 1 2 YQ1 5 0 0 9 2 0 3 ) 和深圳 市科技计划 项 目( J c YJ 2 0 1 2 0 6 1 3 1 7 3 0 4 9 5 6 O ，GJ H 一 $ 2 0 1 2 0 6 2 1 1 5 5 4 3 3 8 8 4 ) 资助 的课题 t通讯作者E ma i l ：h b n i u s z u e d uc n 2 0 1 4 中 国 物 理 学 会C h i n e s e P h y s ic a l S o c ie t y h t t
8、p ： w u l i x b h y 8 c c n 7 物 理 学 报Ac t a Ph y s S i n V o 1 6 3 ， No 2 1( 2 0 1 4 ) 2 1 4 6 0 1 布信息， 因此具有 良好的化学特异性， 并具有高灵 敏度、 高空间分辨率等优点 0 ， ， 广泛应用于生物学 领域中对脂类分子、 蛋 白质和核酸的成像 【 ， 引然 而， 由于光学衍射极限的限制，目前 C ARS 显微成 像技术仅能达到横 向约3 0 0 a m、 轴向约 7 5 0 n m 的 空间分辨率 8 如何突破衍射极限限制， 获得纳米 尺度的空间分辨率成为 目前研究 C ARS 显微成像
9、技术 的首要任务目前国际上关于超分辨 C ARS 显 微成像方法 的报道主要停 留在理论阶段。尚未有实 验结果发表， 这 些理论方法主要归结为 以下三种： 第一种方法 引入一束空心光， 使点扩展函数范围内 周边分子的振动能级实现粒子数反转， 当与探测光 作用时， 点扩展函数周边将不再有信号产生， 信号 仅产生于点扩展函数的中心部分， 从而使点扩展函 数 的范围减小， 实现超分辨 1 0 , 1 1 】 ； 第二种方法是在 点扩展函数周边 引入局域振荡场， 通过干涉的方法 提 高空 间分辨率 1 2 ； 第三种方法采用结构光照明 来提高空间分辨率 1 3 ， 这种方法实验上 已经获得 约 1 2
10、 0 n m 的横 向空间分辨率， 但是不符合超分辨 显微成像技 术空间分辨率小于 1 0 0 n m 的要求， 不 属于严格意义上 的超分辨显微成像方法此外， 以 上几种方法仅限于对分子的单一化学键成像， 很难 实现分子的准确识别和精确定位 我 们 提 出 一 种 附 加 探 测 光 引 起 声 子 耗 尽 ( a d d i t i o n a l p r o b e i n t r o d u c e d p h o n o n d e p le t e d ， A P I P D ) M 】 的C A R S 超分辨显微成像方法， 通过引 入一束空心光作为附加探测光与点扩展 函数范围
11、内周边 的声子相互作用， 而点扩展函数中心部分的 相干声予 声子仍与高斯型探测光作用由于探测光与附加探 测光 中心波长不同， 因而在点扩展函数周边区域和 中心区域产生的 C AR S信号的波长不 同因此， 可 以将点扩展 函数周边 区域产生 的C ARS 信号滤除， 从而实现点扩展函数的改造， 获得突破光学衍射极 限限制的 C ARS 显微 图像 k J , f- ， 当采用飞秒激光 脉冲抽运光子晶体光纤产生的超连续谱光源 1 5 ，l 6 同时作为抽运光与斯托克斯光时， 可同时获取分子 多个甚至是全部化学键 的振动谱 1 7 ， 从而提高分 子识别的准确度和定位的精确度 1 8 , 1 9
12、】 AP I P D超 分辨显微成像方法 中， 作为附加探测光的空心光束 的质量是一个至关重要的因素：空心光在像面的位 置会影响到成像系统的调节， 而空心光强度分布的 圆对称性关系到成像的对 比度， 其暗斑尺寸更是直 接影响CA RS显微成像系统的空间分辨率因此， 我们需严格控制产生空心光束的条件，以期得到 比 较理想的空心光 2 超分辨C A R S 原理 如 图1 f a ) 所示， CA RS过程采 用 中心频 率为 。和 的超短激光脉冲分别作为抽运光和斯托克 斯光来激发分子 共振，当抽运光和 斯托克斯光之 间的频 差满足分 子的某一化 学键 的振 动频率 R 时，即 R： 。一u ，共
13、振激发 产生大量 的相干 声子， 相干声子与探测 光光子作 用将产生频率为 。 = p + p 的 C ARS信号， 其 中 为探 测光的中心频率 ( b ) 有用的c ARs 信号 图1 ( 网刊彩色)( a ) C A RS 过程的能级图； ( b ) 超分辨C A RS 原理图 为突破光学衍射极限， 我们 引入一束空心光作 为附加探测光与点扩展函数周边的声子相互作用， 其基本原理如图1 ( b ) 所示 首先， 抽运光与斯托克 斯光同时到达样 品与样品分子作用， 产生大量 的相 干声子， 随后到达样 品的空心光与相干声子作用产 号 生中心频率为 。 = 一 + ( ，p 为附加探测 光
14、的中心频率) 的CA RS信号， 我们称之为无用的 CARS 信号由于空心光束的光强在 中心很弱、 在 周边较强， 因而附加探测光光子主要与点扩展 函数 周边的声子作用， 即中心频率为 。 的C A R S 信号 2 1 4 6 01 2 物 理 学 报A c t a Ph y s S i n V o 1 6 3 ， No 2 1( 2 0 1 4 ) 2 1 4 6 0 1 主要产生在点扩展函数的周边区域空心光与声子 作用结束后， 高斯型探测光到达样 品， 此时点扩展 函数范 围内周边的绝大部分声子 己被消耗， 仅剩下 点扩展 函数 中心部分的大量声子可与探测光光子 作用， 产生 中心频率为
15、 。 的CARS信 号， 我们称 之为有用的CARS 信号由于附加探测光中心频率 与探测光 的中心频率 不同，因而产生 的无 用 CARS信 号和有用 CARS 信号在频谱上 是分 隔 开 的， 可 以通过特定的滤光片将无用 C ARS 信号滤 除， 达到缩小点扩展 函数的目的， 从而实现超分辨 在 AP I P D超分辨 显微 成像 技术 中，抽运 光、 斯托 克斯光、 附加探 测光和探测 光均为 脉宽约为 1 0 0 f s 的飞秒激光脉冲为 了最大程度地激发分子 键共振， 抽运光脉冲和斯托克斯光脉冲须同时到达 样 品， 从而产生大量 的相干 声子由于空心附加探 测光仅与点扩展函数周边的声子作用， 且产生 的信 号为无用的 C ARS信号，因而可与抽运、 斯托克斯 光脉冲 同时到达样 品附加探测光与相干声子作用 结束后， 高斯型探测光到达并与 占扩展函数中心的 声 子发生作用， 高斯型探测光与抽运、 斯托克斯光 脉 间的时间延迟可 以有效地抑制非共振背景， 提高 CARS 显微成像系统的信噪比 AP I P D超分辨显微成像技术通过引入一束空 心光实现 点扩展函数的改造， 获得超光学衍射极限 的分辨率我们用全量子理论分析了这一过程， 并 得 到超 分辨 C ARS显微成 像技术的横 向空间分辨 星 基 1 4 ， 2 0 】 r= n
