《实验十二-水中细菌总数和大肠杆菌检测24页》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验十二-水中细菌总数和大肠杆菌检测24页（24页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验十二 水中细菌总数与大肠菌群的测定一 实验目的n1、掌握细菌总数的测定方法n2、掌握大肠杆菌的鉴定和计数 方法n3、巩固无菌操作技术1.细菌总数测定原理用营养琼脂倾注平板，测定被检物在单位重量或体积（g或ml）内所含有的活细菌数量，以判明被检物被细菌污染的程度。二 实验原理2 大肠杆菌鉴定原理n大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、需 氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该 菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污 染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中 有否染肠道致病菌的可能。n 样品中大肠菌群系以100mL（g）检样内大肠 菌群最大可能数（MPN)表示。细 菌 学 检 验 程 序样品细菌总
2、数 大肠菌群水样稀释或不稀释 水样稀释或不稀释 第一步- 初步发酵试验倾注平板培养 （乳糖发酵） 37 24小时 37 24小时菌落计数 第二步- 平板分离培养 （取平均数报告） （转种鉴别培养基）37 24小时革兰染色镜检第三步- 乳糖复发酵试验报告结果三、实验器材1、恒温培养箱（361 ）、恒温水浴锅 （461 ） 、天平、灭菌培养皿、试 管。2、培养基及试剂：n 乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂平板（ EMB）、牛肉膏蛋白胨培养基1.以1ml无菌吸管吸取样品1ml加入9ml 无菌生理盐水， 使样品（自来水、饮用水、饮料等）成 1：10 、1 ：100 、1：1000 等几个稀释度；样品（下水
3、道水、牛奶）稀释度要适当高。 2.分别在无菌平皿内加入1：100、1：10、原样的样品 各1ml，每个稀释度均做一个平板。注意 ：先加浓度低的样品，再加浓度高的样品 3.将冷却45的营养琼脂倾注于平皿中，摇匀，置37 培养24小时。四、实验步骤-细菌总数测定平皿分4部分点数（见图）求同一稀释度的平均菌落数如： A1数 + A2数 + A334、菌落计数：1）平板菌落数的选择2）稀释度的选择3）菌落数的报告菌落数100 按实有数报告菌落数100 采用两位有效数，后面数 值 四舍五入（也可用10的指数表示）无法计数 无法计数报告 （ 注明水样的稀释倍数）5. 菌落计数的报告：稀释度的选择：1. 应
4、选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘 以稀释倍数报告之2. 若有两个稀释度其生长之菌落数均在30-300， 则应视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报 告平均数。若其比值大于2则报告其中较小的数字。3. 若所有平均菌落数均大于300，则应按稀释度最 高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。4. 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按 稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。5. 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间 ，其中一 部分大于300或小于30时，则以最接近30 或300的平均菌 落数乘以稀释倍数报告之。6. 若所有稀释度的菌落数均不可计数，则以最高 稀释倍数无法计
5、数 报告之。稀释度选择及细菌总数报告方法稀释液及菌落数10-1 10-2 10-3 1 1,365 164 20 16，400 16，000或1.61042 2,760 295 46 1.6 37，750 38，000或3.8 1043 2,890 271 60 2.2 27，100 27，000或2.71044 不可计 4，650 513 513，000 510，000或5.1 1055 27 11 5 270 270或2.7 1026 不可计 305 12 30，500 31，000或3.1 1047 不可计 不可计 不可计 10-3无法计数稀释倍数平均菌落 数 例 次两稀释度菌落数之比细
6、菌总数(个/g或个/ml)报告方式 (个/g或个/ml)菌落计数的报告:菌落数 报告结果1、 30300 之间 平均菌落数 X 稀释倍数 2、 求比值 2 取较小稀释倍数 在30300之间 300 最高稀释度平均菌落数 X 最高稀释倍数 4、 300 30 6、 无法计数 报告无法计数取最接近的 X 稀释倍数 (若有两个稀释度)五、大肠菌群的检测检品胆盐乳糖发酵管伊红美兰平板大肠杆菌菌落纯培养乳糖复发酵管（-） 乳糖复发酵管（） n1、检样稀释n以无菌操作将检样1mL放于含有9mL灭菌生理盐水或 其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成 1：10的均匀稀释液。n用1ml灭菌吸管吸取1：1
7、0稀释液1mL，注入含有9mL 生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做 成1：100的稀释液。n另取1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀 释液。n根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选 择三个稀释度，每个稀释度，接种3管，每支试管接 种1ml。n2. 乳糖发酵试验n 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置361温箱内，培养24h2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行。3.分离培养n 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平
8、板上，置 361温箱内，培养18h24h，然后取出，观察菌落 形态并做革兰氏染色和证实试验。 4.证实试验n在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰 氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361的温箱内培 养24h2h，观察产气情况。n凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告 为大肠菌群阳性。 5.报告n根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每 100mL（g）食品中大肠菌群的MPN 值。表1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数 MPN100mL(g）95%可信限1mL(g)3 0.1mL(g) 3 0.01mL(g) 3下限 上限000000000 12330306
9、0905 900000111101233060901205 13000002222012360901201600000333301239013016019011110000012340701101505102002101111 1111012370110150190103023036011112222012 311015020024030 360 11113333012316020024029022220 0 0 00 1 2 390 140 200 26010 30360 37022221 1 1 10 1 2 3150 200 270 34030 70440 89022222 2 2 20
10、 1 2 3210 280 350 42040 100470 15002 2 2 23 3 3 30 1 2 3290 360 440 530 3 3 3 30 0 0 00 1 2 3230 390 640 95040 70 1501200 1300 38003 3 3 31 1 1 10 1 2 3430 750 1200 160070 140 3002100 2300 38003 3 3 32 2 2 20 1 2 3930 1500 2100 2900150 300 3503800 4400 47003 3 3 33 3 3 30 1 2 32400 4600 11000 240003
11、60 710 150013000 24000 48000大肠菌群测定 挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；红色、粉红色菌落。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。 产酸判断：紫色培养液变成黄色产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试 管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生， 需进一步试验。 饮用水、乳、冷饮食品卫生标准的细菌指标指 标细菌总数 大肠菌群饮用水 100个/ml 3个/L 消毒牛奶 30，000个/ml 40个/100ml瓶装汽水、果味水及果汁类饮料品 种 100个/ml 5个/100ml五、实验报告（一）、列表记录并计算实验结果 （二）、思考题 1、怎样判断分离到的微生物是大肠杆菌 ？ 2、接种了微生物的培养皿为什么要倒置 培养？实验准备（2个样品）n培养皿：10套/组n无菌水：10支（9毫升/支）n乳糖胆盐发酵培养基：18支试管、5ml/支 100mln伊红美蓝琼脂培养基（EMB）:100ml，4个平板n牛肉膏蛋白胨培养基:150ml，6个平板
