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1、食用菌菌种制备技术食用菌菌种制备技术菌种:原意是指孢子(相当于植物的种子) ,但在实际生产中,常将经过人工培养的纯菌丝体连同培养基质一同叫做菌种。菌种分为母种(一级种) 、原种(二级种)和栽培种(三级种)三级。母种(一级):将纯菌丝体或孢子在试管培养基中繁殖而成。可以繁殖原种,也适宜菌种保藏。原种(二级):母种菌丝在固体培养基上繁殖而成。这一过程增强菌丝对培养环境的适应性,又起到扩繁的作用。原种可以直接出菇。栽培种(三级):由原种扩繁而成。主要是为了扩繁,为生产提供足够的菌种。菌种制备:也称种子制备,是指菌种在一定条件下,经过扩大培养成为具有一定数量 和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵
2、罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。 种子制备包括孢子制备和菌丝体制备(见图)。其中(1)(4)为孢子制备过程。保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种,无菌操作挑取少 许,接入琼脂斜面培养基上,在 25(或较高温度)下培养 57 天(或较长时间)。所得 孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子,对于霉菌类孢子制备,多数 采用大米、小米之类的天然培养基。将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液,接种到扁瓶固体 培养基上,于 2528培养 14 天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干,使水分降至 10%以 下,并放入 4冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。放线菌孢 子的培养基大多是采用麸
3、皮或豌豆浸出液、牛肉膏及无机盐与琼脂制成的。将斜面孢子接 入扩大的扁瓶孢子培养基中,于 2837培养 514 天。所获得的大量孢子可直接作为 种子罐 (6)的种子。 如果有些生产菌种不产孢子,如赤霉素产生菌或产孢子不多的如果有些生产菌种不产孢子,如赤霉素产生菌或产孢子不多的,则可采用摇瓶(则可采用摇瓶(5)液)液体培养制得菌丝体,作种子罐的种子。体培养制得菌丝体,作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发 芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源(如葡萄糖) 和氮源(如玉米浆等),及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐(7)的种子应是生命力旺盛、 染色深
4、、菌丝粗壮,无杂菌及异常菌体。接种量一般在 10%20%。一、母种的制备 用试管制成斜面培养基,并接种原始试管种(保留种),并用于生产的母种即为生产母种,可用于扩接原种。 1培养基配方 配方一 马铃薯培养基:马铃薯 200 克、葡萄糖 20 克、琼脂 20 克、水 1000 毫升、PH 值自然 ;配方二 综合马铃薯培养基:马铃薯 200 克、葡萄糖 20 克、磷酸氢二钾 2 克、硫酸镁 0.5克、维生素 B1 10 毫克、琼脂 20 克、水 1000 毫升、PH 值自然 ;配方三 合成培养基:马铃薯 20 克、葡萄糖 20 克、磷酸二氢钾 2 克、蛋白胨 10 克、牛肉膏 5 克、酵母膏 5
5、克、硫酸镁 0.8 克、水 1000 毫升、PH 值自然;2培养基制作方法 先将马铃薯洗净去皮切成薄片,称取 200 克,加水 1000 毫升,煮沸 15-20 分钟,用4 层纱布过滤,取其滤液并补足水至 1000 毫升,加入琼脂 20 克,再加热,琼脂溶化后,再加入其它配方中的药品。 培养基的分装,应在培养凝固前进行(琼脂培养基 40凝固)一般用漏斗,或分装瓶,下端连接一段软橡皮管,橡皮管下面再连接一小段玻璃管,在橡皮管上安装一个止水弹簧夹,分装时将玻璃管细口插入试管内,应注意不使培养基黏附在试管口上,以免杂菌感染,每支试管装入量为试管长度 1/4。装好后塞上棉塞,每 10 支试管扎一捆,棉
6、塞上用塑料纸封扎好,用线绳捆扎起来。 3灭菌 将分装后的试管扎捆好,放入高压蒸气灭菌锅,在 1.1kg/cm2压力下(锅入温度达121)灭菌 30 分钟,使微生物包括芽孢全部杀死。待压力降到 0 度时,慢慢放出锅内气体,试管取出后趁热将试管口一端垫高,斜靠在桌上的小木棒上,使管内培养液斜面上长度达 2/33/5,试管上面覆盖毛巾,冷却后即成斜面固体培养基。4接种、培养 斜面冷却后通过无菌操作方法将菌种接入,置 28、3 天后将温度降至 24继续培养,7-15 天左右,菌丝长满整个试管斜面,即成(生产)母种。为检验培养基灭菌是否彻底,可在常温下放置 48 小时,未发现有杂菌产生,即可接种、培养,
7、长满菌丝后即可转管或转接原种。二、原种、制备 母种接种到原种培养基上,进行扩大繁殖育种即为原种,原种一般采用广口瓶或袋装。 1培养基配方 配方一 木屑麸皮培养基:阔树木 78%、麸皮 20%、糖 1%、石膏粉 1%、水 65%; 配方二 棉籽壳木屑培养基:棉籽壳 80%、木屑 15%、 糖 1%、麸皮 5%、过磷酸钙3%、石膏粉 1%; 2拌料与装袋 选用新鲜无霉变原料,根据生产所需的数量,计算配料总量,将麸皮、石膏粉均匀的混合在培养料里,糖和过磷酸钙溶于水后,按上述干料量加入水,比例为 1:1.3 拌匀,培养料含水量 60%为宜,含水量以手紧握培养料指缝间有水欲滴为宜。堆闷 30 分钟后,装
8、瓶(袋)。用机械或人工装袋稍加压实,在袋口外套入塑料环,形成象瓶子一样,然后在袋口内塞松紧适宜棉塞、或用牛皮纸包扎好。 3灭菌 原种灭菌方法有两种,高压灭菌和常压灭菌。高压灭菌又称加压蒸气灭菌,灭菌原理:在高温(121以上)、高压(1.1kg/cm2)条件下灭菌 23 小时,将芽孢在内的微生物全部杀死。常压灭菌称流通蒸气灭菌,由于灭菌设备、条件和基本因素的不同,温度变动在90103之间,其热力、穿透力不强,在一定温度下维持足够时间达到灭菌目的,通常在100下维持 1012 小时。 4接种与培养 不论用接种箱或接种室接种,在接种前,需对接种箱或接种室用 0.2%的来苏水或漂白粉进行消毒处理,然后将灭菌过的料瓶(袋)放在箱内,用烟雾剂密闭薰蒸消毒。接种室消毒,一间房需点燃 3 盒 50 克规格烟雾剂;接种箱消毒每次仅用重量为 4 克,一支母种试管可接 4-6 瓶(袋)原种。将接种后的菌种瓶(袋)放入发菌室培养。培养室温度 2226,相对湿度 70%以下,发菌期间应保持良好的通风条件。原种从接种到菌丝长满瓶(袋)需 30-40 天。 三、栽培种制备 原种进一步扩繁,即为栽培种。栽培种一般采用塑料袋制备,用无棉盖体封口。一瓶原种可接 50-60 瓶(袋)栽培种。栽培种培养基配方及拌料、装袋、灭菌、接种、发菌管理与原种相同。