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1、一、实验原理一、实验原理银染是一种重要的 PAGE 染色方法，由于其成本低，所用试剂安全、快速、灵敏 度高而被广泛应用。银染的原理是银离子在碱性 pH 环境下被还原成金属银， 沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出凝胶上低于 1 ng/蛋白质点，故广泛的用在 2D 凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶 中。这里介绍的是一种实验室常用的银染方法，主要是用于垂直凝胶电泳中低 丰度蛋白的检测。二、实验试剂二、实验试剂1. 乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或 EDTA 钠 盐、去离子水、甲醛。三、实验步骤三、实验步骤1. 固定量取 100ml 乙醇，25m
2、l 冰醋酸加去离子水到 250ml(视胶板大小情况，适当等 比例配制，增加固定液量，以下相同。)，使其终浓度达到 40% 乙醇，10% 冰 醋酸。将凝胶板浸入固定液中，固定 30min 以上。2. 水洗去离子水浸泡。3x 10 min。2. 致敏生物科研 提醒：量取 75ml 乙醇，17g 乙酸钠或 28.2g 三水乙酸 钠，0.5g 硫代硫酸钠加去离子水到体积 250ml。将固定后的凝胶板拿起，浸入 致敏液中，浸泡 30 min。4. 水洗去离子水浸泡。3x 10 min。5银染0.625g AgNO3、100 ul 37%甲醛（在使用前加入）加去离子水到终体积 250ml。将胶板浸入银染
3、液中，浸泡 30 min。6水洗去离子水浸泡。3x 20 sec。注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色 偏黄色。水洗不充分，背景较深。7显色6.25 g Na2CO3、50 ul 37% 甲醛（在使用前加入）加去离子水到终体积 250ml。2-15min，显色时间视凝胶大小、厚薄情况而定。看到各条带，即可将 凝胶捞出。8终止3.65g EDTA 钠盐或者 1g 甘氨酸加去离子水到终体积 250ml。浸泡凝胶 10 min。9保存1% 冰醋酸，4 。四、注意事项四、注意事项1银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。2固定时间较长，则加一步水洗 30min，以
4、免胶太脆而破碎。3最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到 点清晰。4对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干 扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用 Rapid Fix 脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。5银染液和显色液需要预冷。6所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染。7SDS 凝胶中的巯基乙醇会导致在 60 KDa 或 67 KDa 处出现两条水平线。减少 巯基乙醇的用量即可避免。8染色、水洗等过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择 40-60 rpm。没有设 备，用手推轻晃亦可。9凝胶表面的裂纹多是由于
5、压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应 带手套。10凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电 导率小于 1 S 的去离子水。丙烯酰胺中的杂质也会导致呈现较深的背景。11如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是 在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。12在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100 和两 性电解质这些干扰性物质。13室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问 题。14当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效。改变固定剂和染色之前 对胶进行漂洗可以改进染色效果。15据称戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高 40 倍。在染色效果不佳的 情况下可以考虑。16银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带会变浅，而背景会加深。17不同蛋白质对银染反应不一样，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此不宜用 银染测定不同蛋白的比例。
