《普萘洛尔对人肝星状细胞增殖、凋亡及致肝纤维化作用的影响冯宝宝》由会员分享，可在线阅读，更多相关《普萘洛尔对人肝星状细胞增殖、凋亡及致肝纤维化作用的影响冯宝宝（48页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、山东大学硕士学位论文普萘洛尔对人肝星状细胞增殖、凋亡及致肝纤维化作用的影响专业：内科学( 消化病学)硕士研究生：冯宝宝导师：张春清教授中文摘要目的：食管胃底静脉曲张是门脉高压症的严重并发症，一旦破裂可造成大出血，危及患者生命。普萘洛尔( 心得安) 是目前预防肝硬化静脉曲张破裂出血的最常用药物，需要长期、足量给药。但肝硬化病人长期服用普萘洛尔是否会对患者肝星状细胞活化及肝纤维化产生影响，目前尚不得而知。而对肝硬化有无促进或抑制作用是给肝硬化患者长期服药时需要考虑到的问题。本研究以肝纤维化的关键细胞一肝星状细胞为研究对象，采用细胞培养和分子生物学技术，观察p 受体阻滞剂普萘洛尔对人肝星状细胞( H
2、 e p a t i cS t e l l a t cC e l l ，H S C ) 的增殖、凋亡以及致肝纤维化作用的影响，目的是探讨普萘洛尔对肝星状细胞形态和功能的影响，从而阐明肝硬化患者长期服用普萘洛尔对肝纤维化有无潜在的促进或抑制作用。方法：采用H S C L X 2 肝星状细胞系作为活化肝星状细胞的研究模型，在培养的肝星状细胞中分别加入不同浓度的盐酸普萘洛尔( 1 0 p m o l L 、2 5 I - t m o l L 一、5 0 x m o l L 、1 0 0 I _ t m o l L 。) ，于2 4 小时收集细胞，观察H S C 的生长情况。采用水溶性四唑盐- I (
3、 W a t e r - S o l u b l eT e t r a z o l i u m 1 ，W S T - 1 ) 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测不同药物浓度下肝星状细胞的增殖情况，流式细胞仪( F l u o r e s c e n c eA c t i v a t e dC e l lS o r t i n g ，F A C S ) 检测细胞凋亡情况。提取细胞蛋白成分，用W e s t e r nb l o t t i n g 法检测a 平滑肌肌动蛋白( a S m o o t hM u s c l eA c t i n ，QS M A ) 表达水平。提取细胞培养液上清，用酶联
4、免疫吸附测定( E n z y m eL i n k e dI m m u n o s o r b e n tA s s a y , E L I S A ) 法检测转化生长因子1 3 1 ( T r a n s f o r m i n gG r o w t hF a c t o r - 1 3 1 ，T G F 1 3 1 ) 、基质金属蛋白酶一2 ( M a t r i xM e t a l l o p r o t e i n a s e 2 ，M M P 2 ) 以及胶原I 、I I I 的表达水平。数值用均值标准差( 工5 ) 表示，不同组间结果的比较用单因素方差分析( O n e w
5、a yA N O V A ) ，两个组之间的比较采用最小显著差山东大学硕士学位论文( t h eL e a s tS i g n i f i c a n tD i f f e r e n c e ，L S D ) t 检验，P O 0 5 ) 。普萘洛尔处理组H S C 的增殖与正常对照组及生理盐水组相比明显受到抑制，且有显著性差异( P O 0 5 ) 。普萘洛尔各处理组H S C 表达仅S M A 的量与正常对照组及生理盐水组相比降低，且有显著性差异( 尸 O 0 5 ) 。S SK D4 3K D3 IK DS SK D +3K D 3 IK D -图4W e s t e r nb l
6、o t t i n g 检测Q - S M A 结果自左至右6 条条带依次为：正常对照组、生理盐水组、l O p m o l L 。1 普萘洛尔组、2 5 1 m a o l L 。酱荼洛尔组、5 0 1 a m o l L 。1 普萘洛尔组以及1 0 0 1 m a o l L J 普萘洛尔组。表3 普萘洛尔对H S C 表达0 L S M A 的影响与正常对照组相比P ( 0 0 5 ，与生理盐水组相比P ( 0 0 55 普萘洛尔对H S C 分泌T G F - p l 的影响：结果表明，生理盐水组H S C 分泌T G F p l 的量与正常对照组相比没有统计学差异( P 0 0 5
7、) 。普萘洛尔处理组山东大学硕士学位论文H S C 分泌T G F - p l 的量与正常对照组及生理盐水组相比减少，且有显著性差异( P 0 0 5 ) 。普萘洛尔处理组H S C 分泌I I I 型胶原的量与正常对照组及生理盐水组相比减少，且有显著性差异( P ( 0 0 5 ) ，普萘洛尔浓度越高，H S C 分泌I I I 型胶原的量越少( 表7 ) 。表7 普萘洛尔对H S C 分泌I I I 型胶原的影响与正常对照组相比J D O 0 5 ，与生理盐水组相比P ( 0 0 5山东大学硕士学位论文讨论慢性肝脏疾病是一类在世界范围内严重危害人类健康的常见疾病，其中肝纤维化在此类疾病进展
8、过程中起到关键作用，其主要病理改变为汇管区和肝小叶内过度沉积以I 、I I I 型胶原纤维为主的E C M ，但尚无假小叶及再生结节的形成。若病变继续进展，引起小叶改建、假小叶和结节形成，肝硬化的发生就会不可避免。肝硬化会对肝脏造成诸多不良影响n ，包括：( 1 ) 纤维间隔中存在的血管将肝动脉和门静脉的血流直接分流出肝脏，减少与肝实质的接触；( 2 )胶原纤维的沉积导致肝窦毛细血管化，阻碍血流与肝细胞接触；( 3 ) 肝动脉与门静脉之间的交通支开放，使门静脉压力增高；( 4 ) 小叶中心的纤维化阻碍血流进入肝静脉，进一步加剧门静脉高压。肝硬化是不可逆性疾病，发展到晚期会出现肝功能衰竭、门静脉
9、高压和多种并发症，其中门脉高压症所致食管胃底静脉曲张破裂引起的急性上消化道出血是临床上常见的急危重症之一，首次出血死亡率约为2 0 - 4 0 ，2 年内再出血率高达7 0 ，是肝硬化患者死亡的主要原因。而大量的实验和临床证据表明，作为肝硬化早期病变的肝纤维化是可逆的口2 。1 副。因此，研究肝纤维化的发生机制，进而从各个环节阻断肝纤维化的发生、发展具有极其重要的意义。近年来的研究发现，尽管不同病因导致肝纤维化的机制不同，但他们具有一个共同点，即都有H S C 的参与，H S C 是纤维化反应的重要效应器和细胞因子的主要来源和靶点n0 | 。H S C 于1 9 世纪由K u p f f e
10、r 首次发现和描述，历称I t 0 细胞、贮脂细胞及窦周细胞等，位于肝窦内皮细胞和肝细胞之间的D i s s e 间隙中，约占肝脏固有细胞总数的1 5 、间质细胞总数的1 3 ，正常情况下处于静止状态，不表达a S M A ，其主要功能n 田有：储存和代谢维生素A 、调节肝窦血流n 刀和E C M 的产生等。由于细胞分离与鉴定方法的日益成熟和基于此进行的大量研究，其在肝损伤和肝纤维化发生过程中的重要作用已被证实。在肝脏受损及各种慢性肝脏疾病时，坏死肝细胞的膜成分、毒性代谢产物以及炎性细胞的浸润都可以激活K u p p f e r 细胞，后者被激活后释放出多种细胞因子，如T G F p 、P D
11、 G F 、T N F a 与R O S ( 过氧化氢、超氧游离基) 等，这些细胞因子可作用于H S C ，使H S C 失去脂质并发生形态学改变，转化成为肌成纤维母细胞( M y o f i b r o b l a s t ，山东大学硕士学位论文M F B ) 。M F B 可表达a S M A 和多种细胞因子及其受体，产生大量的以I 、I I I型胶原为主的E C M ，合成、分泌组织金属蛋白酶抑制因子( T i s s u eI n h i b i t o r so fM e t a l l o p r o t e i n a s e s ，T I M P s ) ，抑制金属蛋白酶( M
12、 a t r i xM e t a l l o p r o t e i n a s e s ，M M P s )的活性，从而抑制E C M 的降解，促进肝纤维化的形成。前面提到，肝纤维化继续进展会导致肝硬化，后者发展到一定程度会出现门脉高压等严重并发症，尤其是门脉高压所导致的食管胃底静脉曲张破裂出血( E s o p h a g e a lG a s t r i cV a r i c e a lB l e e d i n g ，E G V B ) ，给人们的身体健康和生命安全造成了极大的威胁。普萘洛尔为非选择性的B 受体阻滞剂，具有阻滞D 1 与p 2受体的双重作用，能够降低心输出量和内脏血流
13、量，其降低门静脉压力和预防E G V B 的作用非常明显。自1 9 8 0 年L e b r e e 首次使用普萘洛尔治疗门静脉高压症以来 2 1 ，现已广泛应用于临床。血液动力学研究证实普萘洛尔可平均降低肝静脉压力差( H e p a t i cV e n o u sP r e s s u r eG r a d i e m ，H V P G ) 基础值的1 2 - 1 6 ，并能显著减少奇静脉的血流量和降低食管曲张静脉的压力。约1 3 1 2 患者H V P G降至1 2m m H g 以下或较基础值降低2 0 0 , 6 以上，能够有效预防E G V B 的出血或再出血。程金伟等对9 项随
14、机对照临床试验进行m e t a 分析后得出，普萘洛尔预防肝硬化上消化道初次出血和再出血的作用显著，并可明显降低总死亡率以及出血、再出血所致的死亡率n 8 驯。非选择性的B 受体阻滞剂( 普萘洛尔或纳多洛尔) 已成为预防静脉曲张首次出血或再出血的标准治疗药物口1 。普萘洛尔( 心得安) 是目前预防肝硬化静脉曲张破裂出血的最常用药物，需要长期、足量给药，但肝硬化病人长期服用普萘洛尔对患者的肝纤维化及细胞外基质分泌有无影响、对肝硬化有无促进或抑制作用是给肝硬化患者服药时需要考虑到的问题，关于普萘洛尔对肝纤维化的影响目前未见研究报道。本研究运用细胞培养和分子生物学的方法，通过检测普萘洛尔对人H S
15、C 增殖、凋亡以及T G F 1 3 1 、a S M A 、M M P 2 、I 、I I I 型胶原表达的影响，探讨普萘洛尔对肝纤维化的影响，从而阐明肝硬化患者长期服用普萘洛尔对肝纤维化有无潜在的促进或抑制作用。1 普萘洛尔对H S C 活化、增殖及凋亡的影响肝纤维化的主要特征是大量的E C M 过度沉积于D i s s e 间隙中。目前普遍认为激活的H S C 是E C M 的主要来源细胞啪1 ，H S C 的活化、增殖和分泌是肝纤维化发生的中心环节瞳，因此，抑制活化的H S C 增殖以及合成分泌E C M ，是防山东大学硕士学位论文治肝纤维化的基本策略。H S C 位于肝窦内皮细胞和肝
16、细胞之间的D i s s e 间隙中，正常情况下处于静止状态，不表达伍S M A 。在肝脏受损及各种慢性肝脏疾病时，H S C 在多种因素作用下被激活，转化成为M F B ，后者可表达多种细胞因子及受体，合成、分泌大量E C M ，并表达a S M A ，具有收缩功能【2 副。G r e s s n e r 等根据已有的研究结果，提出了H S C 活化的“三级级联反应模式”1 ，即：( 1 )炎症前期阶段：肝细胞受损后释放T G F - a 、E T o l 等细胞因子启动活化；( 2 )炎症阶段：坏死的肝细胞、炎症细胞被邻近的K u p f f e r 细胞吸收，后者被活化后和单核细胞以及血小板释放T G F B 、P D G F 、E G F 等多种细胞因子促使H S C转化成M F B ；( 3 ) 炎症后期阶段：M F B 合成分泌T G F B 、P D G F 等细胞因子，通过自分泌和旁分泌的方式促进自身增殖
