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1、中山大学博士学位论文男性不育患者不同来源精子非整倍体检测及其临床应用姓名：欧建平申请学位级别：博士专业：妇产科学指导教师：庄广伦2003.4.20男性不育患者不同来源精子非整倍体检测及其临床应用博士研究生：欧建平指导教师：庄广伦教授中山大学附属第一医院生殖医学研究中心摘要生殖是人类传宗接代方式，不孕是人类自然淘汰过程，辅助生育技术是对传统生殖方式的挑战，让原来丧失生育能力夫妇获得后代。从1 9 7 8 年诞生的常规体外受精与胚胎移植( I nv i t r of e r t i l i z a f i o na n de m b y ot r a n s f e r ，I V E E T )
2、到1 9 9 2 年开始出现单精子卵胞浆注射技术( I n t r a c y t o p l a s m i cs p e r mi n j e c t i o n ，I C S I ) ，人们一直非常关注的辅助生育技术对出生后代的安全性问题。然而，I V F E T 已经成为广泛应用的技术。1 9 8 9 年在世界范围内进行了一次合作性调查，对8 1 6 9 1 个I V F E T 周期和超过9 0 0 0 个出生的婴儿进行调查。收集到开始应用I V F E T 以来其中1 6 3 6 3 个婴儿的数据，其中有2 6 7 例有先天性畸形( 占1 6 ) 。T e s t a r t等人认
3、为与一般人群相比，I V F 并不增加先天性畸形的发生率。但I V F 单胎婴儿与对照组单胎相比，低体重和围产期流产率的危险性增加。不育症值得注意问题是男性不育，在生育年龄的夫妇中占1 0 一l5 。在不育因素中男性不育占4 0 5 0 ，男性不育病因包括少精子症、弱精子症、畸精子症、无精子症和抗精子抗体所致的免疫性不育等。男性不育与很多遗传性和非遗传性的因素有关，不宵男性的遗传缺陷有各种临床表现，从促性腺激素释放激素缺乏，生精衰竭到t ! _ l 三殖道结构异常。非遗传性的因素包括生殖道感染、既往腹股沟手术、慢性疾病、放、化疗以及暴露于有害化学物如苯系物等。丽男性t ；1 1 ：育患者中有2
4、 0 是无精子症。遗传学研究表明，有7 11 的无精症患者有染色体异常，其中包括染色体数目异常，如4 7 ，X X Y 核型( 克氏综合征，K l i n e f e l t e rr ss y n d r o m e ) ；染色体结构异常和Y 染色体微缺失等。染色体异常与不明原因反复流产、死胎和不育相关。人类大多数非整倍体是由染色体数目异常的生殖细胞引起，起源于减数分裂过程中染色体的不分离产生多倍体精子。自从1 9 9 2 年P a l e r m o 首次应用I C S I 治疗男性不育以来，该技术已被广泛应用成为治疗男性不育最有效手段。其受精率及妊娠率与正常精液I V F 的结果相当。附
5、睾取精技术从开放性的附睾显微切开精子抽吸术( M E S A )发展到微创的经皮附睾精子抽吸术( P E S A ) ，睾丸取精也从创伤性的睾丸活检抽提术( T E S E ) ，发展到简单微刨的睾丸精子抽吸术( T E S A ) 。显微手术及配子操作令众多的严重少精或无精症男性成为父亲。每个治疗男性不育的成功突破，都增加了将遗传异常传递给后代的危险性。人们开始关注该技术的安全性，因为该技术在应用于人类前，并没有足够的动物实验作安全性评估，随意选择并注射条精子入卵胞浆巾，跨越了自然受精的很多解剖与生理的步骤。B h a s i n ( 2 0 0 0 ) 对6 9 8 2 个男性进行筛查发现
6、，与般人群相比，不育男性染色体异常的发生率明显增高( 5 3 比0 6 ) 。性染色体和常染色体异常的发生率分别是般人群15 倍和6 倍。同样的研究表明，约5 的不育男性带有染色体异常，其中4 有性染色体异常，而1 有常染色体异常。男性不育的遗传学分析表明，克氏综合征是最常见的性染色体异常，在新出牛的男性中的发生率为1 5 0 0 ，在无精子症的男性中占1 1 ，在少精子症的男性中占0 7 。O h a s h i 等人( 2 0 0 1 ) 的研究表明，严重少精症的男性比少精症或正常精子的男性中具有较高的X Y 二体，而两组的X X 二体和Y Y 二体率的基本相同。这些数据显示，第一次减数分
7、裂而不是第二次减数分裂中的性染色体的分裂不分离，将导致能够完成精子发生的一些细胞的X Y 二体的发生率上升，引起其它细胞不能完成精子发生，导致严重少精症。研究结果表明，在严重少精症男性精子中有极大的X Y二体机会，是由第次减数分裂的不分离引起的。这X Y 二体的增加将导致I C S I 后4 7 ，X X Y 胎儿的轻微上升。最近M a c a s ( 2 0 0 1 ) 报道I C S I 受精卵染色体数日异常的发生率升高，而这些异常是来源于父亲的，应用荧光原位杂交( F l u o r e s c e n c ei n s i t uh y b r i d i z a t i o n ，F
8、 I S H ) 可以检测到非阻塞性无精症的精子( 宰丸精) 染色体异常，尤其是性染色体非整倍体的发生率比阻塞性无精症的精子( 附宰精) 和射出精要明显升高，用睾丸精子获得的妊娠，其来源于父亲性染色体数目异常的机率要增加。近年来随着辅助生育技术的不断发展，对精子染色体异常的评估越来越受到人们的重视。尽管与一般人群相比，I C S I 出生小孩的主要先天性畸形的发生率并没有I I升高( V a nS t e i r t e g h e m ，2 0 0 2 ) 。但人们关注I C S I 后的性染色体的异常，来源于父方，可能把男性不育的原因传递给后代。这种医源性传递遗传缺陷可导致严重的长远的影响
9、。因此，有需要与男性不肯夫妇讨沦与I C S I 有关的非整倍体危险性增高的可能性，并考虑对胚胎进行谨慎的种植前遗传诊断。在I C S I 前筛查精予的性染色体的非整倍体，给患者提供有效的遗传信息和咨询。有关精子非整倍体的研究，其实早在1 9 7 8 年人们就用去除透明带的仓鼠卵穿透实验进行精子非整倍体的研究。荧光原位杂交技术的发展，大大促进了精子非整倍体的研究。在过去的1 0 多年里，有一些文章报道了关千用荧光原位杂交研究去凝集精子的染色体异常率。最初的研究使用单个D N A 探针。这个方法是有缺陷的，因为它不能区分染色体二体和二倍体细胞。近来很多研究都采用多色的F I S H ，更有效的进
10、行非整倍体的研究。目前国外有几个用F I S H 方法研究不肯男性精子非整倍体率的报道，有2 个研究报道认为在牛育和不育组的非整倍体率没有差异。其它的研究报道不育男性与正常对照相比，精子的非整倍体率上升。报道结果的差异很大，是因为这些研究中的男性不育类型不同，例如少精、弱精、少弱精、少弱畸形精、无精症、不明原因不育和有抗精子抗体等。另一个因素是有一些研究检查的精子数相对少，也有些研究在不育组中没有检查染色体的核型。些病人可能有异常的染色体，如：4 6 ，X Y 4 7 ，X X Y 嵌合体，这将导致精子X Y 二体的增加。国内对非整倍体的研究已有关于苯系物等有害物质接触环境对人精子染色体数日畸
11、变的报道，极少讨论有关辅助生育治疗中不育男性精子非整倍体的研究，尚没有结合精子非整倍体分析对克氏综合症病一7 严重男性不育患者实施辅助生育技术的安全性，从以下三方面进行探讨。1 无精子症病人染色体核型分析2 严重男性不肯不同来源精子的染色体非整倍体率分析3 克氏综合症病人I C S I 治疗最终目的是为严重不育患者进行I C S I 治疗的町能性与安全性提供有嫂的遗传信息。I I I 第一部分无精子症病人在辅助生育治疗前进行染色体核型分析I l研究对象2 0 0 1 年1 月至2 0 0 2 年6 月在助孕专科门诊就诊和在生殖中心进行治疗的无精子症男性共l8 5 例。所有无精子症病人均需在I
12、C S I 前抽血检查染色体核型( 在中山大学达安基因诊断中心进行) ，性激素测定，以及进行睾丸活检了解生精功能及了解睾丸曲细精管中有无成熟精子。l8 5 例无精子症病人年龄2 5 4 5 岁( 平均3 3 135 2 0 岁) ，不育年限1 年一1 4 年( 平均4 9 7 2 7 5 年) 。女方均为原发性不孕。2方法在无菌条件下，抽男性外周静脉I l t1 5 m l ，加肝素抗凝。加入5 m l 淋巴细胞培养液R P M I1 6 4 0 中，轻轻摇匀，置于3 7 培养箱中培养6 9 小时。每2 4 h轻轻摇匀一次。在培养终止前加入秋水仙素( 2 n g m l ，1 m 1 ) 。把
13、培养7 2 h 后的血液倒入离心管，15 0 0 转m i n 离心1 0 r a i n ，去上清液，然后用低渗液0 0 7 5 M 氯化钾和固定液甲醇：冰醋酸( 3 ：1 ) 处理3 0 r a i n 。在15 0 0 转m i n 离心1 0 m i n ，然后固定3 0 m i n ，反复二次。最后将细胞悬液滴任清洁的玻片上，用胰蛋白酶消化，G i e m s a ( 吉姆萨) 染色1 0 分钟，镜F 阅片。3结果I8 5 例无精子症男性中染色体正常者戈1 4 5 例，占7 8 4 。染色体异常者共4 0 例，发生率占2 1 6 。见表一。表一1 8 5 例无精症男子染色体异常核型染
14、色体异常核型例数染色体异常发生率( ：4 7 ，X X Y1 47 5 64 6 X Y + ( 大Y )1 686 54 6 X Yi n v ( 9 )31 6 24 6 X Y1 q h +31 6 24 6 ，X Y ( 小Y )1O 5 44 6 ，X Y ，1 5 p +1O 5 44 6 ，X Yt ( 5 ：1 3 )10 5 44 6 ，X Yq 一( Y n 0 5 。非阻塞性无精子症病人睾丸精子的非整倍体率与阻塞性无精子症病人附睾精子非整倍体率相比无显著性差异，P 0 0 5 。各组精子性染色体非整倍体率均比1 8 染色体非整倍体率明显增高，P 0 0 5 。正常对照组精
15、子和严重少精症组精子的染色体X Y 二体率( 0 2 2 ，O 5 9 ) 均比对应的X X 二体率( 0 1 0 ，0 2 5 ) 和Y Y 二体率( 0 0 8 ，0 3 0 ) 明显增高，P D n 工但比Y Y二体率( O 2 0 ) 明显增高，P o 0 5 。各组精子性染色体X X 二体率和Y Y二体率之间均无显著性差异，P 0 0 5 。第三部分荧光原位杂交检铡精子非整倍体率在K l i n e f e l t e r ，s 综合征辅助生育抬疗的应用1研究对象l3 例克氏综合征不育男子来自中山大学附属第一医院的生殖中心门诊，年龄为2 6 岁一3 8 岁，平均年龄3 0 2 9 3
16、 4 9 岁。外周吐I L 淋巴细胞的染色体核型均为4 7 ，X X Y 。13 对夫妇均为原发不育，不育年限为卜7 年，平均4 5 4 1 2 0 年。有1 0例克氏综合征不育男子射出精液巾没有精子，其中l 例行睾丸活检，未能找到精子，曲细精管组织透明样变性。其余9 例因睾丸细小柔软而没有进行睾丸活检。3 例为严重少、弱精男子愿意进行I C S I 治疗，其中l 例已经进行I C S I 治疗，2 例正在准备治疗。l 例病人在I C S I 前后分别取精子进行F I S H 检查，以确定其非整倍体率。其临床资料如下：克氏综合征病人3 1 岁，妻子3 0 岁，原发不孕6 年来诊。男方体检：身高17 3c m ，体重5 5k g ，身材瘦长，双侧睾丸体积细小，均约为6m l 。男方的精液检查发现严重少弱精，精液经过直接离心检查，每1 0 个高倍视野才找到l 条精子，活动力a b 级。
