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1、第二章 原核生物分子克隆的宿 主和载体系统本章节主要内容l用于DNA复制的特殊大肠杆菌品系lDNA克隆载体l细菌DNA转化方法l基因克隆的噬菌体系统2第一节 应用广泛的细菌宿主一、E. coli K12 的生物学l革兰氏阴性细菌l没有核膜和染色体l一个环状双链DNA分子，有一个复制起点l细胞中能维持质粒DNA的复制l生活周期较短，20min分裂一次l能在发酵罐中高密度生长l能在平板上培养出单克隆3A) lac operon结构以及表达特性二、乳糖操纵子lac Z: -gallactosidase (-半乳 糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖 ）lac Y: lactose permease（半
2、乳糖苷 透性酶，运送乳糖透过细菌的细胞壁)lac A: transacetylase（半乳糖苷乙 酰转移酶，去除由半乳糖苷透性酶吸收 的有毒的硫代半乳糖苷 thiogalactoside)lac I: 乳糖阻遏蛋白基因Plac :乳糖代谢结构基因的启动子PI : 阻遏蛋白基因的启动子CAP：代谢激活蛋白结合位点4阻遏蛋白四聚体不仅能被别乳糖结合，也能被与别乳 糖结构类似的物质如IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖）结合 ，这种能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解的 分子，称为安慰性诱导物5二、乳糖操纵子l利用-半乳糖苷酶及其基因l-半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物X-gal 形成蓝色物质，可用此
3、反应来检测细胞中 -半乳糖苷酶的活性。6a-互补显色反应（蓝白斑筛选 ）lacZ -半乳糖苷酶-分解半乳糖iPO调控蛋白-肽段分解X- gal产物呈现蓝色诱导剂 IPTG-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M157a-互补显色反应（蓝白斑筛选）总结细菌菌株野生 型突变体 （Lac Z-基 因）突变体+无外源片段 插入质粒 （ Lac Z-+ Lac Z）突变体+有 外源片段插 入质粒 （ Lac Z- ）Lac Z 蛋 白有无（仅有 片段）有（+片段）无（仅有 片段）底物X-gal 分解情况蓝色 菌落白色菌落蓝色菌落白色菌落抗生素抗性无无有有8第二节 质粒载体一、质粒的基本生物学特征l质粒是染色体外
4、稳定遗传的复制体，其特点共价 闭环，双链DNA分子。l大都数质粒具有复制原点，能独立进行复制，不 依赖寄主的细胞复制周期。质粒 9l质粒通常赋予寄主一些表型特征，如抗 生素抗性等。l选择性标记(selectable marker):由于 质粒携带的基因，可供实验室条件下进 行选择的一些标记。如抗性，营养元素 的利用等。显性质粒与隐性质粒.第二节 质粒载体10二、质粒的大小和拷贝数l相对分子量从 1kb到250kb不等。分子量较小 的适合实验室利用l拷贝数严谨型:少数拷贝存在于细胞中（1-几个）松弛型:多个拷贝存在于细胞中（10）严谨型与松弛型是相对的。第二节 质粒载体11（1）、反义RNA进行
5、调控的机制 （plasmid Col E1 ）RopdimerPRNAIIRNA IIA、在复制起点处， RNA II（长555个碱基）与质粒DNA形成 RNA-DNA复合物，RNA酶H的降解RNA II ，露出3自由羟基， 质粒复制起始。三、调节拷贝数的机理(质粒的复制，补充知识)12B、 如果RNA I和RNA II形成双链RNA螺旋，RNA酶H不能 降解RNA II，复制不能进行。RopdimerPRNAII RNA II13C、 当质粒的浓度比较高 的时，RNA I和RNA II形 成双链RNA螺旋，使质粒 的复制不能起始。 D 、 当质粒的比较低时 ，RNA II与质粒DNA形成 R
6、NA-DNA复合物，RNA酶H 降解RNA II 质粒复制起 始。 E、突变RNA I或去除Rop 基因导致质粒的拷贝数 增加。14(2 )关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 （ pS101质粒）A 复制原点区域含有37拷贝的长度为1722bp的 重复区域，R1、R2、R3等。15(2)关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理B、复制原点附近有一个编码基因repA,编码RepA蛋 白。 RepA是双功能的蛋白：与复制原点区域的重复序列结合，起始DNA的 合成；与自身基因的启动子结合，抑制自身的转录 。16质粒拷贝数由RepA蛋白浓度和质粒自身的浓度 进行调节。 如果质粒拷贝数高， RepA蛋白与
7、自身的启动子区 域结合，抑制转录，RepA蛋白合成受阻，DNA的复 制受到抑制。RepA蛋白通过结合到两个质粒的重复序列把它们连 接起来，避免复制起始。 细胞分裂后，拷贝数和RepA蛋白的浓度降低， RepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNA 的合成 。(2 )关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理17问题：在寄主复制后，质粒是如何分 配到子细胞中？Par原件会附着在细胞膜上，随着细 胞的分裂，质粒正确 分配到子细胞中， 维持相对稳定的质粒拷贝数。18第二节 质粒载体四、相容性l在没有选择压力的情况下，两种亲缘关 系密切的不同质粒，不能够在同一寄主 细胞系中稳定地共存的现象，称为质粒 的
8、不相容性，或称为不亲和性（Plasmid incom- patibility)。这样的两种质粒 称为不亲和质粒19第二节 质粒载体l引起质粒的不相容的机理A 具有相同的复制调控机制B 控制质粒分配的par元件相同,也会引 起质粒的不相容l不相容群：指那些具有不相容性的质粒组 成的一个群体，一般具有相同的复制子 ColE1/pMB120五、基于大肠杆菌的克隆载体克隆载体：是一种能携带外源DNA片段进入受体 细胞，并在受体细胞中得到维持或表达的DNA分 子。通常由天然的质粒、噬菌体或动植物的病毒改 造而成。 1 质粒克隆载体的命名法pBR322“p” 代表质粒“BR”代表构建的实验室“322”区别
9、于其他的质粒21五、基于大肠杆菌的克隆载体2、质粒载体的一般特性（1）具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。 （2）具有选择标记基因 （3）具有若干限制酶单一位点 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数22R7268 ApRR1 drd 19 ApR CmR SmR SuR KmRpMB3 ApR pSF2124 ApRpBR312 ApR TcRpSC101 TcR12pM88pMB9 TcR34ColE1566pBR313 ApRTcRpBR322 ApR TcR78pMB1(b )五、基于大肠杆菌的克隆载体3、第一个人工构建的遗传载体234、改进了的载体（pUC载体乳糖选择质粒 ）l具有更
10、高的拷贝数l重组体的识别只需要一步l拥有更多的多克隆单酶切位点五、基于大肠杆菌的克隆载体24pUC载体乳糖选择质粒p(1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)；p(2)氨卞青霉素抗性基因(AmpR)，但它的DNA核苷酸序列已经 发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点；p(3)大肠杆菌-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基 因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ基因；p(4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠近5端 ，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有 不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并 不破坏lacZ 基因的功能。25
11、26pGEM载体克隆DNA的体转录p加入了两个短片段，这两个片段在限制性 酶切位点的两侧，可被T7噬菌体的RNA聚 合酶或SP6 T7噬菌体的RNA聚合酶的识别p方便了克隆DNA的体外转录，便于研究RNA 加工，合成蛋白质等的研究等五、基于大肠杆菌的克隆载体27多拷贝 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ 装有两个噬菌体的强启动子用于外 源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的 RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌 体RNA聚合酶，如E.coli BL21（DE3） 等2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3ZPSP6p
12、GEM-3Z：28第三节 噬菌体克隆载体l1 噬菌体的基本特征l裂解周期l溶源l2 溶源性噬菌体l原噬菌体l溶源菌l噬菌体，M1329l噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48 502bp。l基因簇集排列l线噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期l线性噬菌体两端各有12个碱基的5凸出黏性末端 是互补的,该互补序列相互作用形成cos位点。作用：进入细胞的DNA通过两端的黏性末端环化。作为内切酶的识别位点一、 噬菌体的生物学3031321、对野生噬菌体的改进A、 删除多余的限制性内切酶的位点。B 、切除一些非必需序列，增加载体的容量。C、设计阳性选择重组子的方法。D、设计可方便地通过
13、转录作用制备外源插入DNA的 RNA探针的载体E、发展可以使插入的真核cDNA与半乳糖苷酶 形成融合蛋白的载体。 二、基于噬菌体的克隆载体332、噬菌体基因组可删除的部分不影响生存能力l噬菌体基因组中可以删除的序列与噬菌体进入从裂解 状态进入溶源状态以及从溶源状态进入裂解状态有关， 即与噬菌体整合和脱离大肠杆菌的染色体相关l删除了这部分序列的噬菌体只能进行裂解循环二、基于噬菌体的克隆载体343、噬菌体载体可分为q插入型载体：只具有一个可供外源DNA插 入的克隆位点。失去了非必需区切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因 后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选可插入长度为10kb的
14、外源DNA二、基于噬菌体的克隆载体35两种报告基因的插入型载体lcI基因内保留HindIII和EcoRI单酶切位点，当有 外源DNA在这酶切位点插入时，使cI基因失活，感 染hf-大肠杆菌后可形成空斑（ 如gt10） 。l在噬菌体DNA插入的lacZ基因末端设有单一的 EcoR酶切位点。在此处插入外源基因，可表达 -半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特异性抗体或 DNA测序方法可筛选重组DNA。这类载体适宜构建 cDNA文库(如ZAPII)二、基于噬菌体的克隆载体36q替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 DNA区段可以被外源插入的DNA所取代。可克隆的片段大，最大可达23kb，而质粒最
15、大仅10 kb左 右；DNA的长度大于野生型噬菌体DNA长度的75而不超过 其105时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于 野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降， 因此要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。二、基于噬菌体的克隆载体37三 克隆载体的体外包装l体外包装：模拟噬菌体DNA分子在宿主细胞内发生的 包装过程，将重组的噬菌体DNA分子包装成成 熟的具有感染能力的噬菌体颗粒l必要性：噬菌体重组分子直接感染大肠杆菌的效 率较低，而在试验过程中，因内切酶的处理， DNA的连接产生的有效分子等原因，使得转染效 率更低38三 克隆载体的体外包装39三 克隆
16、载体的体外包装l单菌株体系缺陷型噬菌体在cos位点有突变， 噬菌体的DNA复制不能完成，但可形成 外壳蛋白，可以制备包装所必须的各种外 壳蛋白。40三 克隆载体的体外包装3 双菌株的体外包装原理 A 噬菌体的头部和尾部的包装是分开进行 B 头部基因发生突变的噬菌体只能形成尾部 C 尾部基因发生突变的噬菌体只能形成头部 D 两种不同突变的噬菌体混合起来，能在体 外装备形成有活性的噬菌体颗粒41Lyse, mixAdd ATP and concatemerized DNAMature phage particles42重组噬菌体的鉴别lacZ基因功能选择方法 类似于质粒中的蓝白斑筛选cI基因功能选择法 cI 插入失活的噬菌斑是“清澈”的，而野 生型正常的噬菌斑是“浑浊”的435.4 重组噬菌体的鉴别Spi-（sensitive to P2 inhibition）正选择A 野生型噬菌体，不能在P2噬
