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1、第21卷 第3期大 学 化 学2006年6月薄层色谱分析法及其进展汪瑗 朱若华 陈惠(首都师范大学化学系 北京100037)摘要 介绍常规薄层色谱和几种高效薄层色谱分析方法,薄层色谱与红外光谱、 表面增强拉曼光谱、 核磁共振、 质谱、 电化学等联用检测技术,以及薄层色谱与联用检测技术在医药、 生物制品、 毒物、 环境有害物质、 食品及其他领域定性定量分析中的应用,并对其前景进行了展望。薄层色谱( thin layer chromatography, TLC)是一种快速、 简便、 高效、 经济、 应用广泛的色谱 分析方法。薄层色谱的特点是可以同时分离多个样品,分析成本低,对样品预处理要求低,对固
2、定相、 展开剂的选择自由度大,适用于含有不易从分离介质脱附或含有悬浮微粒或需要色谱 后衍生化处理的样品分析。TLC广泛地应用于药物、 生化、 食品和环境分析等方面,在定性鉴 定、 半定量以及定量分析中发挥着重要作用。常规的TLC法存在展开时间长、 展开剂体积需 求大和分离结果差等缺点。高效薄层色谱法是近年来迅速发展的一种高效、 快速、 操作简便、 结果准确、 灵敏度高和重现性好的薄层色谱新技术,已广泛用于各个领域。下面对薄层色谱方法、 薄层色谱检测技术和薄层色谱应用的新进展进行介绍。1 常规的薄层色谱方法TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。常规薄层色谱的 固定相为未
3、改性的硅胶、 氧化铝、 硅藻土、 纤维素和聚酰胺等,平均颗粒度20m,点样量15L,展开时间30200min,检测限15ng。以正相色谱占主导地位,设备简单,所需资金投入 少;不足之处是分离所需时间长,有明显的扩散效应。周漩等1 在硅胶G薄层板上用氯仿 2 乙酸乙酯 2 甲醇 2 水(体积比15:40:22:10)作展开剂,测定了人参皂甙的Rf值,并计算描述了在正 相薄层色谱中人参皂甙结构与保留值之间的关系。谢丽华等以乙酸乙酯 2 无水乙醇 2 水(体积比4:1:0. 6)为展开剂,玄参的特征性有效成分哈巴俄苷(harpagoside)和哈巴苷(harpagide)为 对照品,对不同产地玄参药
4、材以及数种易混淆药材进行检测,建立了中药玄参薄层色谱鉴别 法,方法操作简便、 准确、 可靠。2 高效薄层色谱高效薄层色谱(HPTLC)采用更细、 更均匀的改性硅胶和纤维素为固定相,对吸附剂进行 疏水和亲水改性,可以实现正相和反相薄层色谱分离,提高了色谱的选择性。C2、C8和C18化学 键合硅胶板为常见反相薄层板。高效板厚平均100250m、 点样量0. 10. 2L,展距36cm,展开时间320min,最小检测量0. 10. 5g,较常规TLC可改善分离度,提高灵敏度和43重现性,适用于定量测定。2. 1 棒状薄层色谱棒状薄层色谱(TLC2FI D)是用石英棒作支持物涂上硅胶,点样、 溶剂展开
5、。样品在色谱棒上分离后,将棒通过适当的机械传动装置穿过氢火焰离子化检测器火焰中心,使化合物燃烧裂 解,形成离子碎片和自由电子,再由电极收集并产生与化合物量成正比的电流信号,从而测出 各物质的含量(图1)。该方法优点是灵敏度高,操作简便,薄层棒可反复使用,通用性好,可用 于非挥发性、 没有可见及紫外吸收、 没有荧光以及衍生化困难的有机化合物的定性定量分析, 被广泛地应用于工业、 食品、 药物及医学等领域。杜国华等2 利用TLC2FI D方法测定了不同来源、 不同种类的催化裂化原料油的烃族组成。将重油样品用甲苯溶解后点在SIII型色谱棒 上,正庚烷和甲苯分次展开后,转移到氢火焰上扫描,得到试样中饱
6、和烃、 芳烃、 胶质以及沥青 质的分离薄层色谱图。图1 棒状薄层氢焰扫描仪示意图2. 2 加压薄层色谱加压薄层色谱(OPLC)是指在水平的薄层色谱板上施加一弹性气垫。展开剂不是靠毛细作用力,而是靠泵压被强制流动,因此可以采用更细颗粒的吸附剂和更长的色谱板,分离所需时间缩短,扩散效应减小,分离效果更好。2. 3 离心薄层色谱离心薄层色谱(CTLC)又叫旋转薄层色谱,是一种离心型连续洗脱的环形薄层色谱分离技术,主要是在经典的薄层色谱基础上运用离心力促使流动相加速流动。离心力用于分离,可以减少破坏,对沸点高、 分子量大的化合物有利,可用于分离100mg左右的样品。使用商品化生产的离心薄层色谱仪,仪器
7、结构简单。尽管其分辨率低于制备型HPLC,但操作简便,分离时间短,并且无须将吸附剂刮下即可将产物洗脱下来,广泛应用于合成和天然产物的制备分离。徐晨等3 采用离心薄层色谱法提取大豆磷脂酰胆碱(SPC) ,速度快,溶剂消耗量少,制备样品量大,成本低。用硅胶GF254、 和CaSO41 2H2O,加聚丙烯酸钠水溶液混合均匀,铺制薄层盘,烘干,薄层盘可重复使用5次以上,洗脱液: CHCl32CH3OH2H2O。2. 4 胶束薄层色谱Ar mstrong在1979年首次研究了胶束薄层色谱(miceller thin layer chromatography,M2TLC)。胶束薄层色谱分正相胶束薄层色谱和
8、反相胶束薄层色谱两种。正相胶束薄层色谱是在聚酰胺、 氧化铝或硅胶薄层上用低浓度表面活性剂的水溶液为展开剂;反相胶束薄层色谱是在硅烷化的硅胶薄层上用低浓度含少量水的非极性有机溶剂为展开剂。胶束薄层色谱能使53一些结构相似、 难溶于水的化合物得到较好分离。微乳液与胶束同属于低粘度的缔合胶体,同 样存在表面活性。与胶束相比,微乳液是由表面活性剂、 助表面活性剂、 油和水等在一定配比 下自发形成的无色透明、 低粘度的热力学稳定体系,具有更大的增溶量和超低界面张力。微乳液作为展开剂,对待测成分具有独特的选择性和富集作用,更有利于提高色谱效率,可同时分 离亲水物质、 疏水物质、 带电成分、 非带电成分等。
9、胶束薄层和微乳液薄层主要用于三次采油、 痕量金属离子的回收和生物碱分析。胶束薄层色谱的最大优点是很少使用有毒、 易挥发、 易 燃、 易造成污染的有机溶剂,并且使用方便、 操作简单和经济廉价。闻璃毓等4探讨了微乳薄层色谱法用于同时分离鉴定中成药中多种有效成分,以十二烷基硫酸钠(SDS)2 正丁醇 2 正庚烷 2 水微乳液为展开剂,聚酰胺薄膜为固定相,通过一次点样展开,分别检测出抗感冒颗粒剂和 防风通圣丸中黄芩甙、 绿原酸、 防风、 大黄素、 大黄酚等多种成分。用含水量75%的此微乳液 为展开剂还可分离和检测13种黄连药材、 饮片及中成药5 。操作简便,分离效果理想,检出灵 敏。2. 5 包合薄层
10、色谱( I CC)1983年, Fuji mura等首次把环糊精键合到硅胶表面,制成键合固定相,并用于薄层色谱,以 后关于环糊精固定相的合成、 改性、 应用有了不少报导。2 环糊精(2CD)是由7个葡萄糖分 子通过21, 4糖苷键连接而成的环状低聚糖。由于其特殊的结构,能够在它的疏水空腔中选 择性地包结各种客体分子,形成具有不同稳定性的包结配合物,从而达到分离效果。 2 环糊精 还可作为薄层色谱的展开剂和增敏剂。这种包合薄层避免了使用有毒、 易挥发、 易燃的有机溶剂,具有较高的选择性,适用于分离普通化合物,同分异构体及光学异构体。方艳红等6 用2 环糊精(2CD)作为流动相手性添加剂,流动相组
11、成为 2CD饱和溶液 2 甲酸 2 甲醇,在反相C18薄层色谱板上分离了d、l2 色氨酸。王小萍等7 以环糊精水溶液为流动相,聚酰胺薄膜为固 定相,反相薄层色谱法研究了中药大黄有效成分大黄素、 芦荟大黄素与环糊精的包结作用,测 定了包结常数。朱全红等8 设计并制备了3, 52 二硝基苯甲酰基取代的 2 环糊精薄层色谱键合固定相,用于拆分丹磺酰化氨基酸对映体。该键合相合成方法简单,性能稳定,适用于正相 和反相液相色谱。以乙腈 21% ()乙酸三乙胺 2 乙酸为展开系统,可使8对丹磺酰化氨基酸对映体都能得到良好分离。2. 6 二维薄层二维薄层(2D TLC)是分离多组分复杂混合物的一种有效方法,基
12、于在薄层板两个垂直的方向上进行相同或不同机理的展开。将样品点在薄层板的一个角上,展开至适当距离后取出, 挥干溶剂,再将板以与原展开方向成90 的方向展开,第一次展开被分离的组分组斑点,成为 第二次展开的原点。二维薄层的优点在于可以用不同的流动相二次展开,并且在二次展开前, 可以用其他方式处理薄层和已实现组分离的样品。例如二维薄层SRS(分离 2 反应 2 分离)技 术,就是在第一次展开后,进行板上反应,再进行二次展开分离。在二次展开前,还可以点加标 准样。周漩等9 用二维薄层色谱分离人参皂苷,点样后,将薄层板先沿Y轴方向以不同比例的氯仿 2 甲醇为流动相进行展开,展开后吹干,将板置于密闭容器中
13、抽真空以除去残留在板上 的展开剂,然后沿X轴方向以不同比例的正丁醇 2 乙酸乙酯为流动相进行二维展开,结果比一 维展开分离出了更多新的皂苷组分。Pyka10 在硅胶60F254铝板上分别用正己烷 2 乙酸乙酯 2 乙 酸和氯仿 2 正丁醇 2 乙酸 2 水二维展开分离了7种胆汁酸。Amanda综述了一维薄层和二维薄层 的区别以及二维薄层应用的优点。633 薄层色谱检测方法薄层色谱的定量检测有吸收测定法、 荧光测定法和荧光猝灭法。对在可见及紫外光区有 吸收的化合物可用钨灯和氘灯在200800nm范围进行透射和反射吸收法测定。化合物本身 或者经过色谱前和色谱后衍生化生成对紫外有吸收并能放出更长波长
14、的化合物适用荧光法测 量,荧光法灵敏度高,最低可测至pg级。本身无颜色、 又无特征紫外吸收或荧光,并且不易衍 生的化合物可采用荧光猝灭法测量,使用含有荧光剂的薄层板。薄层色谱扫描仪的常见扫描 方式有直线扫描、 锯齿扫描、 飞点扫描、 圆形扫描、 倾斜扫描和多通道自动扫描等,分别采用单 波长或双波长的测光形式。除此之外,薄层色谱还可与其他分离分析技术联用,更有利于化合 物的定性鉴别和定量检测。3. 1 薄层色谱 2 傅立叶变换红外光谱联用检测化合物的红外光谱能提供丰富的结构信息,是定性的有力手段,也可以用于定量。目前薄 层色谱和红外技术联用主要采用原位法、 光声光谱检测法(PAS)、 自动洗脱物
15、转移法和红外显 微镜法11 。原位法是采用改装的DR IFTS附件,由步进马达驱动TLC板,对色谱斑点进行红 外测量。由于TLC固定相有强红外吸收,分析物吸收带容易发生畸变。光声光谱法是将TLC 板上附着有分析物的固定相依次转移到PAS附件中进行FTIR2PAS分析,再用差谱方法扣除 固定相的吸收,得到分析物光谱图。同原位一样,固定相的强红外吸收会对分析物光谱产生干 扰。自动洗脱转移法使用TLC2FTI R自动接口。样品在常规板上展开后,将板旋转90,用螺 丝固定在带有样品杯的金属部件上,杯中充有KBr或KCl粉末,杯底部的金属丝芯和TLC板 接触,将板置于转移附件里,展开的各组分会被转移附件
16、罐里的溶剂推向顶部,借助金属丝芯 的毛细作用进入杯中。转移完,用干燥空气流吹洗各样品杯表面,使杯中溶剂挥发,组分沉积 在杯顶部的KBr表面上,最后进行红外扫描。红外显微镜法是用氧化钴作固定相涂在显微镜 载片上,样品在氧化钴上展开后直接用红外显微镜测量,用氧化钴代替硅胶和氧化铝,可消除 固定相的干扰。3. 2 薄层色谱 2 拉曼光谱联用检测拉曼光谱和红外光谱都属分子振动光谱,前者为散射光谱,后者为吸收光谱,分子偶极矩 越大,红外吸收强度越大;振动时分子极化率改变越大,拉曼散射越强,所以通过两种光谱的相 互配合、 补充,可以更好地解决化合物结构测定问题。薄层色谱和表面增强拉曼光谱(SERS)联用较多。表面增强拉曼要求检测的分子必须含 有芳环、 杂环、 氮原子、 硝基、 氨基、 羧酸基以及磷、 硫原子,因为这些基团可通过孤电子对或 电子与表面增强基底相互作用,从而产生拉曼散射增强效应,样品用量可低至数微克。常用表 面增强基底为银溶胶,通过硝酸银、 柠
