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1、摘要溫度或 pH 值都會對蛋白質的折疊情況造成影響，其影響因蛋白質而異。Snase 在 pH 值=7 時，會折疊成正常狀態（完全折疊） ，在值時已幾乎完成折疊，在 pH 值=時只有部分折疊，值時為一任意捲曲形狀(random coil)。所以本次實驗中我們以觀測跳到時蛋白質的折疊變化，並與理論結果作一比較。我們將以 Photo acoustic calorimetry (PAC)及 photo-thermal beam diffraction (PBD)兩種實驗方法來研究蛋白質在反折疊過程中的熱與體積變化。PAC 測量時間尺度介於 10ns2us 之間，而 PBD 測量時間尺度為 10usms
2、 之間。一、研究動機當蛋白質沒有正確的折疊（誤折）時，可能會產生嚴重的後果，如許多知名的疾病:阿茲海默症(Alzheimers)及帕金森氏症(Parkinsons)等，都因為蛋白質折疊錯誤而無法正常工作，然而蛋白質折疊是個複雜的問題，所以我們所選擇的蛋白質是一個小的蛋白質，在文獻上整個折疊的過程較簡單，折疊完畢後是一個球型。藉由量測蛋白質折疊的訊號，與理論值做一比對，了解蛋白質詳細的折疊過程，甚至能進一步控制它的折疊反應時 ，就能有效控制及治療疾病，造福人群。二、研究目的了解 Snase 在改變 pH 值的條件下，反折疊發生在何種時間尺度，及量測在反折疊過程中的內能與熵的變化並與現在的熱力學模
3、型做一比較。三、實驗器材實驗器材配置簡圖前置放大器為 PBD(photo-thermal beam diffraction)的實驗器材，其功能為收光並把其轉換為電壓訊號。因為其收光處為一 AB 端子(如圖)當光打至正中央時 AB 兩端子所收到的光是一樣多的，不會產生電位差。一旦光出現偏折，產生電位差，其電壓訊號就會顯示於示波器上。吸收光譜儀用以了解樣品對不同波長的吸收程度螢光光譜儀用來測量螢光劑在不同溶液中的放光情形四、研究過程在做實驗之前，我們首先利用鏡子的反射讓整系統內的 Probe laser 經過同一平面(以二維座標為基礎)，因為這樣可簡化光路的複雜性。通常是利用兩面鏡子較好調控光路的
4、上下及左右，這是實驗前的前置作業。將 Probe laser 導至前置放大器的 AB 端子，並使之歸零。接著打開脈衝雷射將其光路導至 ref 中與 Probe laser 交於一點。脈衝雷射會激發 ref 使之放熱，週遭溶劑因熱膨脹而折射率改變後使 Probe laser 產生偏折。此實驗目的在使脈衝雷射及 Probe laser 準確交於一點，並試著從示波器上讀到訊號。接著我們用吸收光譜儀去掃 D-7176 的吸收光譜(A 圖)，接著在不同的 pH 值中加入等量的 D-7176,以 D-7176 吸收最多的波長去打各 pH 值溶液，看其所發出的螢光光譜(B 圖)而得到類似下圖的結果。然後再以
5、 pH=4.5 的溶液為基準液，依次加入 0.5cc 的 o-NBA，利用 D-7176 在不同 pH 值中放出螢光強度不同(pH 值越高，放光的強度越大)來觀察樣品的 pH 值變化。加到 2cc 時原溶液的 pH 值已從4.5 因 o-NBA 被激發後降至 2.88(符合 Snase 從摺疊至反摺疊的需要)，實驗結果如下圖，此溶液將為接下來 Snase 的溶劑。-0.0020.0000.0020.0040.0060.0080.010-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.0Voltage SignalTime (sec)0 mL0.5 mL1.0 mL1.5 mL2.0 mLFinall
6、y, pH=2.88O-NBA = 16 mMpH=4.5, 2 mL接著我們再剛剛調配好的溶液中加入 20uL、4mM 的 Snase，以Probe laser 通過樣品，再經放大器接收顯示在示波器上，校正後再用波長 355 的脈衝雷射激發 o-NBA，使其放出氫離子降低樣品的 pH值。則樣品的折射率可能因蛋白質的展開而改變，使原本穿過樣品的雷射光產生偏折，則放大器所收到的光會因偏折而使 AB 端子接收到不一樣多的光，產生電位差，接著以下是我們初步的研究結果與討論。五、實驗結果PAC（Photo acoustic calorimetry）的原理如下：以下是以我們的實驗數據用電腦轉換成的簡圖-
7、0.0000050.0000000.0000050.0000100.0000150.0000200.000025-0.04-0.03-0.02-0.010.000.010.020.030.040.05PAC signalTime (sec)RefSnase圖一(PAC 的結果)-0.00010.00000.00010.00020.00030.00040.0005-0.08-0.06-0.04-0.020.000.02PBD SignalTime (sec)refSnase圖二(PBD 的實驗結果)六、討論當樣品吸收光子後，會依循兩種路徑，一是放熱後導致樣品周遭溶劑體積發生變化，另一是樣品本身產
8、生結構變化，而 ref 是在此實驗的一種標準樣品，當 ref 吸收 355nm 的光後會 100完全放熱而使周遭溶劑體積膨脹，故將其訊號歸一化後，可拿來做一對比，又因其放熱速率極快，故可量測時間尺度介於 ns2us 左右的事件，但若有比其反應更快的事情發生時，將無法解析。圖一黑線就是 ref放熱後麥克風（壓電晶體）偵測到的訊號，顯示在示波器上的結果，而紅線部分則是 Snase 的結果。由圖中我們可以發現，在橫軸時間尺度上，兩者的行為幾乎是一樣的，這告訴了我們 Snase 因 pH 改變所導致的反折疊過程是快或慢於儀器解析的（快於 10ns，慢於2us） 。在縱軸振幅上，Snase 的訊號比 r
9、ef 小，表示 Snace 有放熱與結構變化存在。為了量測較長時間的結果（3usms） ，我們做了PBD （Photo thermal beam diffraction）實驗。PBD 的實驗原理與 PAC 相似，但不同的是，PBD 並不是用麥克風來偵測訊號，所使用的是一道 Probe laser，所量測到的是折射率的變化，與 PAC 相似的是當樣品吸收光子後，也會依循兩種路徑，放熱或結構改變，受限於放大器反應的關係，一般而言此方法所能量測的時間尺度在 usms 之間。圖二是 PBD 所量測到的初步結果，我們發現在 PBD 的訊號在振幅上與 ref 相同，這在 PAC 上並沒有這樣的結果(振幅上
10、略小於 ref)，這告訴了我們也許 Snase 在這樣的時間尺度下可能有不同於 PAC 之結果，也許多了放熱或結構改變，這需要做不同溫度的實驗才能把這兩個因子分開，這也是我們下一個目標之一。七、結論因為 Snase 為 149 個氨基酸，屬於短鏈的高分子，所以其摺疊或反摺疊所需的時間預估極短。由上述實驗我們得知，時間尺度介於 ns2us 左右所量得 Snase 的訊號，與時間尺度在 usms 之間所量測 Snase 的訊號並不相同，這反應了在 usms 的時間尺度內多了放熱或結構改變，我們還需要做不同溫度的實驗才能把這兩個因子分開。此外我們還要對 Snase 做 x 光的小角度散射實驗已了解其
11、反結構變化的狀況，與我們用 PAC 與 PBD 的方法作一比較。八、參考資料及其他1. Photothermal Studies of pH Unfolding of Apomyoglobin (Journal of Protein Chemistry, Vol. 22, No.4, May 2003) J. Mol. Biol. (2003) 332, 11431153 2. Kinetics of proton transfer in a green fluorescent protein: A laser- induced pH jump study, Roop Mallik, Jaya
12、nt B Udgaonkar and G Krishnamoorthy Proc. Indianl. Acad. Sci. (Chem. Sci.), Vol. 115, No. 4, August 2003, pp 307317 3. Early Events During Folding of Wild-type Staphylococcal Nuclease and a Single-tryptophan Variant Studied by Ultrarapid Mixing, Kosuke Maki1, Hong Cheng, Dimitry A. Dolgikh M.C. Rama
13、chandra Shastry and Heinrich Roder J. Mol. Biol. (2004) 338, 383400 4. pH-Induced Folding/Unfolding of Staphylococcal Nuclease: Determination of Kinetic Parameters by the Sequential-Jump Method? Hueih M. Chen, Vladislav S. Markin, and Tian Yow Tsong, Biochemistry, Vol. 31, No. 5, 1992 5. Least activation path for protein folding: Investigation of staphylococcal nuclease folding by stopped-flow circular dichroism,Z.- D. SU, M. T. AROOZ, H. M. CHEN, CAROL J. GROSS, AND T. Y. TSONG, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996)
