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1、目录基因重组和基因工程基因重组和基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering第14章目录基因重组是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行 切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又 称DNA重组。基因克隆将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中， 使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子， 称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统 称为重组DNA技术或基因工程。目录重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段目录目录目录第一节 自然界DNA重组和基因转移 是经常发生的 DNA Re
2、combination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature目录自然界中DNA重组DNA重组 类型同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specific recombination)转 座 (transposition)DNA重组 方式接合作用 (conjugation)转化作用 (transformation)转导作用 (transduction)细胞融合（cell fusion） 目录（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DN
3、A转移称为接合作用(conjugation)。一、基因重组方式(p347)目录细菌的接合作用目录 可接合质粒如 F 因子(F factor) 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。 质粒目录（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 。目录例1：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取 。目录举例2目录（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。目录噬菌体的生活史溶菌生长途径 (lysis pathway)溶源
4、菌生长途径 (lysogenic pathway)供体细胞受体细胞目录噬菌体两种生长途径（示意图）目录 发生在姐妹染色单体之间或同源序列间的 重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。是最基本的DNA重组方 式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA 分子同源序列间进行单链或双链片段的交 换。 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机 制的Holliday模型。（一）、同源重组是最基本的DNA重组方式二、基因重组类型 (p345)目录nHolliday模型的4个关键步骤： 两个同源染色体DNA排列整齐；片段
5、重组体(patch recombinant)拼接重组体(splice recombinant) 一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA 对应的链连接，形成Holliday中间体； 通过分支移动产生异源双链DNA； Holliday中间体切开并修复，形成两个双 链重组体DNA，分别为：目录 片段重组体 （见模型图右边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。 拼接重组体（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 内切酶(recBCD) DNA侵扰 (recA)分支迁移(recA)内切酶 (re
6、cBCD)DNA连接酶535 35353535353 53535353 535 3533353 5335535353Holiday中间体535353 53Holiday中间体535353 5355 355333355553333555 5333555 5333355553333内切酶 (ruvC)内切酶 (ruvC)DNA 连接酶DNA 连接酶片段重组体拼接重组体目录（二）、位点特异重组，即特异位 点间发生的整合 (P349) 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。目录噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体
7、的特异靶位点发生选择性整合。1、噬菌体DNA的整合目录目录2、细菌的特异位点重组沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。目录hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。目录H2鞭毛蛋白阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛蛋白hinH2IDNA启动子H1启动子沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变目录（三）、转座重组（P350) 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。 大多数基
8、因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。 目录 插入序列(insertion sequences, IS)组成：（一）插入序列转座 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列 特有的正向重复序列：412bp，位于反向重复序 列外侧，为插入序列所特有。 一个转座酶（transposase)编码基因：产物引起转座 ，位于中间。IRIR目录 插入序列发生转座的形式：保守性转座: 从原位迁至新位复制性转座: 插入序列复制后，一个复制 本迁到新位，另一个保留在原位。目录插入序列的复制性转座目录 转座子(tra
9、nsposons) 可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposase Gene有用基因（二）转座子转座 转座子组成： 反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因目录由转座子介导的转座目录第二节 重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 目录相关概念n DNA克隆n 工具酶n 目的基因n 基因载体基本原理 重组DNA技术与医学的关系本节主要内容：目录一、重组DNA技术相关概念 克隆(clone):来自同一始祖的相同
10、副本或拷 贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。（一） DNA克隆目录 技术水平：分子克隆(molecular clone)（即DNA 克隆） 细胞克隆个体克隆（动物或植物） 目录应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗 传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、 天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具 有自我复制能力的DNA分子复制子 (replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛 选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增 提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或 重组DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆目录 目的： 分离获得
11、某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。目录（二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工 具 酶功 能 限制性核酸内切酶识别识别 特异序列，切割DNADNA连连接酶催化DNA中相邻邻的5磷酸基和3羟羟基末端之间间形成磷酸 二酯键酯键 ，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连连接DNA聚合酶合成双链链cDNA分子或片段连连接 缺口平移制作高比活探针针
12、 DNA序列分析 填补补3末端 Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链链合成，双链链DNA 3末端标记标记 等反转录转录 酶合成cDNA 替代DNA聚合酶I进进行填补补，标记标记 或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟羟基末端磷酸化，或标记标记 探针针末端转转移酶在3羟羟基末端进进行同质质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基目录限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列
13、, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCC CCTAGGG CCTAGGATCCG+Bam H 定义：目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 命名：Hin d属 系 株 序Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 分类：、（基因工程技术中常用型 ）目录类酶识别序列特点 回文结构(palindrome) 按切割位点相对于二重对称轴的位置来区分 主要产生3种缺口： 5突出粘性末端3突出粘性末端平端或钝端GGGGA AT TCCCC CCC
14、CT TA AGGGG粘性末端是指经内切酶特异切割后产生的5末端突出 或3末端突出的碱基序列。目录Bam HGTC CAGG CCTAGGATCCG+GGATCC CCTAGGHind GTCGAC CAGCTGGAC CTG+平端切口粘端切口对称轴处切割对称轴两边切割目录 一种是在对称轴5 端切割产生5-突出 末端 一种是在对称轴3 端切割产生3-突出末 端目录来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCC CCTAGGG CCTAGGATCCG+Bam HGGATCC CCTAGGG CCTAGGATCCG+Bst 同功异源酶：目录有些限制性内切酶虽然识别序列
15、不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端 ，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为 配伍未端(compatible end)。Bam Bam HHBgBg l lGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAG CCTAGGATCCG+A TCTAGGATCTA 同尾酶目录（三）目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA)指经反转录合成的、与RNA (通常指 mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以 单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双 链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA)指代表一个细胞或生物体整套遗传信 息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 目录（四）基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁 殖或表达有意义的蛋白质所采用的 一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA目录 克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expre
