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1、植物叶中色素的提取和柱色谱分离实验报告一实验目的1、学习从植物中提取色素的方法。2、学习柱色谱(层析)的原理及其操作方法。3、掌握天然药物化学实验报告的一般写法。二实验原理1、绿色植物叶中含有叶绿素(绿)、胡萝卜素(橙)和叶黄素(黄)等多种天然色素。各种色素能溶解在有机溶剂（无水乙醇等）中形成溶液，使色素从生物组织中脱离出来。2、柱色谱是通过色谱柱来实现分离的。在色谱柱内装有固体吸附剂(固定相)如氧化铝或硅胶。液体样品从柱顶加入，当液体流经吸附剂时，由于吸附剂表面对液体中各组分吸附能力不同而按一定的顺序吸附。然后从柱顶加入洗脱剂(流动相)，样品中的各组分随洗脱剂按一定的顺序从色谱柱下端流出，根
2、据不同颜色分段收集。吸附剂，常用吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁等。吸附剂对化合物的吸附能力与分子的极性有关，极性越强，吸附能力越大，分子中含有极性较大的基团，其吸附能力也越强。溶剂，溶剂分为溶解样品的溶剂和洗脱剂。选择溶剂时还要考虑到被分离物各组分的极性和溶解度。通常是先将要分离的样品溶于非极性溶剂中，从柱顶加入柱中。然后用稍大极性的溶剂使各组分在柱中形成若干谱带。再用极性更大的溶剂洗脱被吸附的物质。为了提高洗脱效果，有时也使用混合溶剂。在本实验中色素成分在不同比例混合洗脱剂的作用下可以分离出来。三实验仪器及试剂仪器：烧杯、量筒、色谱柱、分液漏斗、玻璃棒 、干燥的锥形瓶、滤纸、旋转蒸发仪 、酸式
3、滴定管、布氏漏斗、研钵、胶头滴管、剪刀、天平 试剂：50g 新鲜植物叶、中性氧化铝、甲醇 ( 9 5 ，分 析 纯 ) 、乙醇、 石油醚 ( 6 0 9 0 ) 、丙酮 、无水硫酸钠 、正丁醇 、50g 新鲜植物叶、四实验内容1. 绿叶色素的提取 把新鲜绿叶洗净晾干或用滤纸吸干，称取 5g 绿叶，剪碎后放入研钵，再加 入 10mL 乙醇。研磨后用布氏漏斗抽滤，弃去滤渣。 将滤液放回研钵，每次用 10mL 3:2 （体积比）的石油醚 - 甲醇混合液萃 取两次，每次需加以研磨并且抽滤。把两次滤液合并，转入分液漏斗中。用 5mL 水洗涤两次，弃去水-甲醇层, 洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化。石 油
4、醚层转入干燥的锥形瓶中用无水硫酸钠干燥。干燥后的液体在旋转蒸发仪上蒸除石油醚至体积约 2mL 左右。 2.柱色谱分离色素 取一支干净的酸式滴定管，向柱内加入石油醚至柱高约 1/2 处。再缓慢加 入氧化铝，并打开活塞 ，控制流出速度约为 2 滴/s ，并保持液面不低于固定 相。打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下 12mm 高时关上活 塞。注意，在任何情况下，氧化铝表面不得露出液面。 色素浓溶液用滴管小心加到色谱柱顶部，并要旋转加入。加完后打开下部 活塞，让液面下降到柱面以下 1mm 左右关闭活塞。旋转加入数滴石油醚，重新 打开活塞使液面下降，重复几次使有色物质全部进入柱体内，待色素全
5、部进入 柱体后，观察并记录下此时实验的现象。在柱顶小心加洗脱剂石油醚 - 丙酮 溶液 9:1 （体积比）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用试 管收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一试管收集，得橙黄色溶液，它 就是胡萝卜素。用石油醚 - 丙酮 7:3 （体积比）作洗脱剂，分出第二个黄色 带，它是叶黄素 （1）。再用丁醇 - 乙醇 - 水 3:1:1 （体积比）洗脱叶绿素 a（蓝绿色）和叶绿素 b（黄绿色）。五实验结论与分析1、本次实验总共重复了三次，第一次采用的是蚕豆叶，提取的色素浓液很少所 以色素带分层现象不明显；第二次采用的是野草的嫩叶，提取出来的主要是淡 黄色的色素，叶绿
6、素较少；第三次因为时间关系采用了少量的是莴苣叶比较前 两次实验，很遗憾实验分层现象还是不明显。通过不同品种的原材料的选取， 以及用量的多少对实验很关键，总的来说还是用适当的过量的绿叶较好，可以 避免转移过程中的损失，而且绿叶最好是深绿色的肉质植物。 2、研磨时加入适量的乙醇有助于打开植物细胞壁，有利于色素的流出，第一次 采用的是甲醇，第二次是石油醚，第三次是乙醇，实验结果从提取的汁液来看 第三次的汁液明显是深绿色，第一次是浅绿，第二次是淡黄色。通过查阅文献 和实验比较，提取色素过程中，由于抽滤时不好控制，非极性溶剂难免会被抽 去，且在几次转移中损失较多，程序繁杂。用浸泡法操作简便易行，损失少，
7、 产率高。因甲醇与乙醇的极性相近，乙醇易得，无毒，用 95乙醇通过浸泡的 方法提取菠菜色素为此实验的优化条件 。 3、固定相的选择也是一个影响实验结果的关键，此次试验我们组并未将氧化铝 和硅胶两种固定相一起作比较，但从别组两种比较的结果来看，通过比较，中 性氧化铝虽用量比硅胶稍大，但其装柱 较容易，只要保持比较均匀的速度从 漏斗中加入，且轻轻敲打柱身，柱内气泡就较少，柱子装的也比较实，色带的 分离效果比硅胶明显。使用硅胶做固定相时，虽用量较少，但在装柱过程中， 容易 出现大量泡，会影响色带的分离。为消除气泡，采用吸耳球对柱子加压， 将气泡挤出柱体。但这种方法容易导致柱子的堵塞，而且在加压过程中
8、，脱脂 棉上层的少许沙子常会堵在滴定管的尖嘴处，导致色带分离时溶剂不易滴出， 延长了实验时间，还影响了色带分离效果。但采用硅胶做固定相时，第一个胡 萝卜素的橙黄色带分离效果很好。同时用两种固定相分离时，叶黄素的黄色色 带都分离不够明显，经查阅资料认为叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度较小， 从嫩绿菠菜得到 的提 取液中，叶黄素含量很少，所以柱色谱中不易分出黄色 带。但比较两者，采用硅胶分离时，黄色色带几乎看不出来。因此采取氧化铝 做实验现象更明显。用中性氧化铝作为固定相装柱效果最好。装柱的时候采取干法装柱效果较好。 同时需注意在柱的底部要铺少许的脱脂棉以防止氧化铝堵 塞柱子尖嘴处 。装 完柱后还
9、要在柱的顶部铺一层细沙，当溶剂下降到沙层时 要及时添加，以防柱 身干裂。色谱柱顶部的氧化铝和沙层注意不要倾斜，如果 倾斜会影响色带的分离效果。同时保持 2 滴/s 的速度放出溶液(使色带均匀下 移)，所加压力不要太大。六实验思考1、植物的绿叶在研磨时不要太烂而成糊状导致不容易分离。 2、叶绿素色素对光，温度，氧气，酸，碱及其它氧化剂都非常敏感，故色素的 提取和分离应避光。 3、在洗脱过程中，不要大量放出溶液，以免固定相表面暴露导致柱子干裂。 4、固定相的顶部保持水平，并且柱内应当没有气泡。气泡或倾斜的部会使得流 出柱体的化合物的色带易变形。 5、甲醇有毒，请在通风良好处使用； 6、柱中不可有空气，必要时用装在玻棒上的橡皮塞轻轻敲击柱身； 7、柱中硅胶表面任何时候都不得露出液面，以防有空气进入； 8、待色素全部进入柱体后，方可进行洗脱，以防有拖尾影响分离效果。
