《胎儿骨髓间充质干细胞在体外向软骨组织分化的探讨》由会员分享，可在线阅读，更多相关《胎儿骨髓间充质干细胞在体外向软骨组织分化的探讨（36页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、遵义医学院硕士学位论文胎儿骨髓间充质干细胞在体外向软骨组织分化的探讨姓名：洪嵩申请学位级别：硕士专业：骨外科指导教师：廖文波2003.5.15胎儿骨髓间充质干细胞在体外向软骨组织分化的探讨研究生洪嵩导师廖文波摘要目的探讨骨髓间充质干细胞( m e s e n e h y m a ls t e m e e l l s , M S C s )无支架条件下在体外向软骨组织定向分化的条件。方法取引产胎儿骨髓悬液，经P e r c o l l 密度梯度离心，获取单个核细胞，细胞贴壁、扩增后，再以高糖D M E M ( T G F 邛1 5 n g m 1 ) 进行成软骨细胞预诱导，4 7 天后获得成纤维
2、样单层贴壁的M S C s 。以此M S C s 为种子细胞，2 x 1 0 6 个细胞离心成团，在T G F Dl 与I G F I及其它辅助成分的协同作用下，体外培养3 周后形成组织团块。经固定、包埋、切片后行甲苯氨蓝染色，免疫组化方法测定特异性型胶原。通过图象分析软件检测组织块蛋白多糖和型胶原表达强度，并与胎几正常软骨比较。结果胎几骨髓单个核细胞经过预诱导，细胞表达特异性型胶原，甲苯氨蓝染色蓝染明爨增强；孬经离心威鬻、体外诱导培养嚣澎藏有毙泽软骨群缎家块，其甲苯氨蘸染色爨蓝絷，特异性I I 型胶愿戈豳性表达，隧黎分析表明其蛋由多糖及型胶原表达强度与胎儿正常软骨相似。结论胎几骨髓间充质干细
3、胞经商糖D M E M 预诱导后可向软骨翻簏分托；离心戒霾蓐，在T G F 。1 与I G F - I 及英它骧黯残分瓣协慝作用下具有形成类软骨组织的能力，本实验建立酶定向诱导培养系统在无支架条件下可使M S C s 向软骨样组织分化。荚键词：骨髓嗣一充质干细胞软骨细胞培养生长日子申鼙法分类号：R 3 2 9 。2交藏标谈霹：T h ee x p l o r a t i o no fc h o n d r o c y t i cd i f f e r e n t i a t i o no fm e s e n c h y m a ls t e mc e i l sw i t h o u ts
4、c a f f o l di nv i r t l “ OH O N GS o n 9 1 , A NR o n g - z e 2 , L I A OW e n - b 0 3 ( 1 ，2 ，3D e p a r t m e n to fo r t h o p e d i c s ，z u n y im e d i c a lc o l l e g e , z u n y i5 6 3 0 0 3 ，C h i n a )A b s t r a c t s ：O b j e c t i v eT oe x p l o r et h ec u l t u r ec o n d i t i o
5、 n st h a tc h o n d r o c y t i cd i f f e r e n t i a t i o no fm e s e n c c h y m a ls t e mc e l l si nv i r t r o 。M e t h o d s 翟睦媾C SW e r ei s o l a t e df r o mt h en u c l e a t e dc e l l sf i a e t i o no fh u m a ne m b r y o n i cm a r r o ww a s h i n gf l u i db yd e n s i t yg r a
6、d i e n tc e n t r i f u g e A n dt h e nt h eM S C sw e r ei n d u c e di n t o5c h o M r o e y t eb yT G F - 露l , d e x a m e t h a s c m e , t 0 F B Si n 瓣蘸鬈i uD M E Ma f t e ri 焱t h lc u l t u r eo f1 0d a y si nl o w 霉娘D M E M J m f i a lM S C sw e r et r y p s i n i z e d ，c o u n t e da n dc
7、e n t r i f u g e dt o 鑫s m a l lp e l l e ti na1 5 m lp o l y p r o p y l e n et u b e ；T h ep e U e tM 蛳i n d u c e di n t oc h o n d r o c y t i ct i s s u e 鼯l i m i t e dc u l W x ec o n d i t i o n si nv i r t r o R e s u l t sT h eh i s t o l o g i c a lo b s e r v a t i o no ft h ec a r t i
8、l a g e - l i k et i s s u es h o w e dp o s i t i v es t a i n i n go ft d u i d i n eb l u ei n3w e e k s 。T h ee x p r e s s i o no ft h et y p eI Ico l l a g e nW a Sp o s i t i v et o o 。T h e s eW 翻t es m a i l a rt on a t x n a A 狲揪磊蕊e m b r y o n i ca r t i c u l a rc a r t i l a g e 。C o n
9、c l u s i o n sM S C se 巍疆b eu s e da sf u n c t i o n a lc e l l st oc o n s t r u c tt i s s u ee n g i n e e r e dc a r t i l a g e 。T h ec u l t u r es y s t e mc o u l db eu s e d 埝i n d u c eM S C st oc a r t i l a g e - l i k et i s s u ew i t h o u ts c a f f o l dm a t e x i a L K e yw o r
10、d s M e s e n e h y m a ls t e mc e l l sC a a i l a g eC u l t u r eG r o w t hf h e t o r警前言关节疾惠在临床上十分多觅，冀中籀辫六一鄣分是由于各种擦霞产生翡关节鼓臀破棼所致。关节软骨一旦搂馋，簿泼修复，目前临床常用的治疗方法仅能对症处理、缓解拄状、组织工程学家一直致力予用组织工程化软骨修复病损关节软骨。近年来，嚣髓闽充质子麴胞鑫英强大酶骞我更新、多囱分亿能力霭被篇徽鳃织王程化较嚣的释子细胞瞄 7 ，8 ，9 l ，嚣建囊一辣较好酶诱导培棼体系对于形成组织工程化软骨是至关重要的。以往较常用的方法是以骨髓
11、问充质干细胞的扩增传代后，再进行诱导成有软骨倾向瓣细戆，但是在传代过程串戏较曹细施分化酶袅整容舅垂失。褥本次实骏苔先采耀了愿代M S C s 点接预诱导的方法，试图减少M S C s 的传代遮一步骤，以求能够避免在传代中产生表型丢失的现象。通常M S C s 构建较骨组织必须与支架材料相结合，最终用予澹床。本泼实验淡预诱导褥M S C s 荛种子蠡跑，离心成鼙定淘诱导培养，在惩支架瓣条件下获得救骨样短织。材料与方法| - 糟糕l 。1 标本来源实验括本取皇爨流产酶3 - 6 月龄胎儿共5 铡，4 月龄2 例、5 月龄1 例、3 月龄2 例。取其双侧股骨骨髓及膝关节较骨。1 2 试剂1 2 ，1
12、 低糖及离糖D M E M 、黪牛血清、P e r c o l l ( 礁胶化媳聚乙爝毗咯烷酮) ，均购自G I B I C O 公司。1 2 2C o l l a g e nT y p eHA b - 2 ( C l o n e2 8 1 5 ) ，购自N E O M A R K E R S公司。1 2 。3U l t r a v i s i o nD c t e c t i o n S y s t e m ：A n t i - M o u s e , H R P D A B购自L A B V I S I O N 公司。1 2 4R e c o m b i n a n th u m a nT
13、 G F - B 1 和I G F 4 ，购自P E P R OT E C H E C L T D ，U K 。1 2 5 掰性霉寒B 、青霉素G 、维生素C 、胰蛋媳酶、硫酸链霉素，均购自华美生物工程公司。1 3 耗材1 3 。1 鬟辩离心管、2 5 m l 培养巍、| 2 毳培养教戆骞F A L C O N 公弼。1 3 2 其余细旎培养淡矮滤器、c c h 孵藏、M i l i p o r e 裁拳系统、O l y m p u s 倒置鼹微镜及摄影系统寒宣本院细胞工程实验室，2 方法2 2 1 胎几原代M S C s 酶体外分离、培养采用无菌技术藏取困外翁垂然流产戆髓咒爨双侧黢营，激P
14、B S 反复砖洗曹穗靛至黢篱予发白 6 1 ，收集冲洗液，离心9 0 0 9 ，1 0 m i n ，以P B S 重悬各管泥淀细胞，记数，3 9 “ 1 0 7 m l ，共5 m l 混匀后缓慢将细胞悬液注入5 m lp e r c o l l ( t 0 7 3 9 m 1 ) 液街上，离心1 1 0 0 9 一, 2 5 m i n ，= 蠹取单个核细胞藤，P B S 洗涤溪凌，离心9 0 0 9 ，5m i n ，褥荻P B S 重憋细戆著琵数，以1 6 “ 1 0 5 船n 2 接种于1 0 0 m m 培养皿，并放入小玻片。然后加入2 m l 低糖D M E M 培养液( 畲1
15、0 胎牛胤清，青霉素钠1 0 0 u m l 、链霉素1 0 0 u g m l 、两性霉索B 0 2 5 m g L ) r 4 ，5 1 ，簌5 C 0 2孵麓走，3 7 0 C 、甍囊溪度下培养。培养3 天蓐更换蒗蘩，淡后3 天更换一次，1 0 1 2 灭后形成多个集落。2 2 2 成软骨细胞预诱导以高糖D M E M 培养液( 含5 0m g m lI T S + P r e m i x 、1 0 “ T M 遂塞来松、T G F 仔1 5 n g m l 、青霉素铺1 0 0 u m i 、 链霉素1 0 0 u g 娃、嚣挂霉素B 0 2 5 m g L 、臆氨酸斓喇、秀瀚酸1 0
16、 0 u g m 1 ) 进行预诱导培养n 1 2 一棚，同时以原有低糠D M E M作为对照组，4 天后慕本长满单屡，取出样本以甲苯氨蘸染色、竞疫笺偬方法测定祷异幢联銎胶嚣捡溺镁诱导缀及对黧盔。蘑菇褥用O 0 5 的胰蛋白建3 7 0 C 消化8 1 0m i l l ，收集到第2 代的M S C s 。2 2 3M S C s 酶体外成软臂组织诱导将收集蓟的M S C s 记数，将2 x 1 0 6 个蠡憨蘸入1 5 m l 鳖辫离心管( F a l c o n ) 串，低速鹰心戚蕊( 4 0 0 9 ) ，加入定向诱导高糖D M E M 培葵基5 0 0 u l ，其中合T G F D1 5 n g m l 、I G F 1 1 0 0 n g m l 、1 0 7 M 地塞米松、5 0 u g m l 维生素C 、4 0 u g m l 脯氨酸、1 0 0 u g m l 丙酮酸、5 0m g _
