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1、1两株肿瘤细胞系 HLAI 类分子基因表达水平的鉴定及意义作者：关德莹，沈晗，邵红伟，黄树林【摘要 】 目的 探讨两株常见肿瘤细胞系 Hela 细胞和BEL7402 细胞 HLAI 类分子基因表达水平及其影响 CTL 反应性的可能意义。方法 提取肿瘤细胞的基因组 DNA，利用 PCR 反应在基因组水平鉴定 HLAI 类分子基因的拷贝数情况；提取细胞总RNA， RTPCR 反应合成 cDNA，利用 PCR 反应鉴定肿瘤细胞HLAI 类分子在 RNA 水平的表达情况。结果 两株肿瘤细胞的HLAI 类基因在基因组水平的拷贝数无明显下降；在 RNA 水平上，Hela 细胞的 HLAA、HLAB 和 H
2、LAC 基因均有表达，表达水平无明显下降，BEL7402 细胞的 HLAA 和 HLAC 基因有表达，但 HLAC 基因表达水平降低，而 HLAB 基因未见明显表达。 结论 RNA 水平上，部分 HLAI 类分子基因表达的降低或缺失推测可能是导致 BEL7402 细胞比 Hela 细胞出现 CTL 反应性下降的原因之一。 【关键词】 HLAI 类分子；Hela 细胞；BEL7402 细胞；mRNA2Abstract:Objective To investigate the expression level of HLAI molecule genes in two tumor cell lin
3、es, Hela and BEL7402 and the possible significance of CTL reactions.Methods Genome DNA were extracted from these two tumor lines for detecting the HLAI molecule genes levels by PCR.Total RNA from two cell lines were extracted for RTPCR, HLAI molecule genesexpression on RNA level were judged by PCR a
4、nd agarose gel electrophoresis.Results HLAI molecule genes levels did not decrease significantly on genome level.On RNA level, HLAA, HLAB and HLAC all expressed normally without significant descent in Hela cell line.The expression of HLAA and HLAC were both detected in BEL7402 cell line, but the exp
5、ression of HLAC gene showed significant decease, and no expression of HLAB gene were detected on RNA level.Conclusion At RNA level, reduction or absence HLAI molecule genes expression of Hela cell line were not found, however, the partial descent and absence of HLAI molecule genes expression in BEL7
6、402 cell line was the possible reason for the reduction of CTL reaction.Key words:HLAI molecule；Hela cell line ；BEL7402 3cell line； mRNA人类主要组织相容性复合物（MHC） ，又称为人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA )系统，位于第 6 号染色体短臂（6p21.31）约 3.6Mb1 ，按功能差别可大致分为 HLAI 类分子和 HLAII 类分子两大类，其中 HLAI 类分子在机体的细胞免疫中发挥重要作用。研究发现，抗肿瘤免疫
7、的核心是机体针对肿瘤的细胞免疫反应，其中 CD8+CTL 细胞必需依靠肿瘤自身 HLAI 类分子呈递的肿瘤抗原才能得以活化发挥杀伤作用。但由于肿瘤细胞的遗传不稳定性，会导致 HLAI 类分子的表达下降或缺失，是引起肿瘤免疫耐受形成的重要原因2, 3 。因此，了解肿瘤细胞的HLAI 类分子表达情况对研究如何打破免疫耐受，开展过继性细胞学治疗十分必要。在前期通过 CTL 杀伤实验的研究中发现，CTL 对本室保藏的人宫颈癌细胞 Hela 的杀伤活性要高于人肝癌细胞株BEL7402(结果未发表) ，为探讨此现象的发生是不是涉及到了肿瘤细胞 HLAI 类分子基因的表达变化，本文在基因组水平及 RNA 水
8、平对两株肿瘤细胞的 HLAI 类分子基因的表达情况进行了鉴定分析，现报道如下。1 材料与方法11 细胞4Hela 细胞、BEL7402 细胞均为广东药学院生物制药研究所保藏，健康人外周血由广州市血液中心提供，用人淋巴细胞分离液分离出单个核细胞。12 主要试剂与仪器RPM1640 培养基、胎牛血清购置 Gibico 公司；T4 连接酶、MMLV 反转录酶、 Taq 酶、dNTP、RNaseInhibitor、Oligod T均购自 Fermentas 公司；Trizol 0020 购自 Invitrogen 公司；DEPC 购自 Sigma 公司；DNA Marker DL 2000、100 购
9、自Biotech 公司，基因组 DNA 提取试剂盒购自 Pearl 公司；PCR 仪（Whatman Biometra，TGradient Thermoblock 型） ；电泳仪（BioRAD ，Power Pac 300 型） ；凝胶成像系统（ Tanon 4100型） 。13 细胞基因组 DNA 的提取收集传代培养 24 h 的 Hela 细胞和 BEL7402 细胞，细胞数约为 2106，按照基因组 DNA 提取试剂盒的使用说明进行操作，将提取获得的 DNA 进行 0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。按相同方法，提取健康人外周血单个核细胞（PBMC）的基因组 DNA 作为对照。514 PCR 反
10、应鉴定基因组水平 HLAI 基因的拷贝数情况根据 GenBank 中已公布的人 HLAI 类基因HLAA、HLAB 和 HLAC 核酸序列，共设计 3 对通用 PCR 反应引物，并设计 1 对针对 GAPDH 基因组序列的内参引物，委托广州英骏公司合成，4 对引物序列具体为：PGA1:5cctctgyggggagaagcaa3，PGA2:5gac tcagaagtgctggactc3；PGB1:5gggaggagcgaggggaccscag3，PGB2:5ggaggccatccccggcgacctat3；PGC1:5agcgaggkgcccgcccggcga3，PGC2:5ggagatgggg
11、aaggctccccact3；PGG1:5aaggtcggagtcaacgg3，PGG2:5atc tcgggcgggaatag36用 50 L 反应体系进行扩增，其参数为：95 预变性 3 min后，按 95 25 s、60 30 s、72 80 s 进行 8 个循环反应，然后按照 95 20 s、55 30 s、72 90 s 进行 30 个循环反应，最后延伸 7 min。PCR 产物经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。15 RTPCR 反应鉴定 RNA 水平 HLAI 基因的表达情况分别收集 3106Hela 细胞、BEL7402 细胞及健康人外周血单个核细胞，按 Trizol Rea
12、gent 使用说明进行抽提细胞总RNA，以 RNA 为模板进行逆转录 PCR 反应，反应体系中加入 10 mmol/L 的 dNTPs 2 L、RNaseInhibitor 20 U、OligodT 0.3 g、RNA 模板 6 L、5Buffer 8 L、MMLV 逆转录酶 200 U，加无菌去离子水至终体积 40 L。混匀后 42 反应 60 min，最后90 5 min 灭活 MMLV 活性，4 保存合成的 cDNA。扩增 HLAA、B、C 3 个基因及内参 GAPDH 基因的引物均由 Invitrogen 公司合成。具体序列如下：PRA1:5gacgacacgcagttcgtgc3,P
13、RA2：5ttg gaccgcggcggacatg3； 7PRB1：5accagagcgaggccgggt3 ，PRB2：5ctg gaccgccgcggacac3；PRC1：5cgccgcgagtccgagagg3 ，PRC2：5ctg gaccgccgcggacac3；PRG1：5aggtcggagtcaacggatttg3 ，PRG2:5gtg atggcatggactgtggt3用 50 L 反应体系进行扩增，其参数为： 94 预变性 3 min，按 94 60 s，55 40 s，72 60 s 进行 35 个循环反应。2 结果21 基因组 DNA 的提取鉴定0.8%的琼脂糖凝胶电泳
14、结果显示试剂盒法提取的 Hela 细胞、BEL7402 细胞及健康人 PBMC 基因组 DNA 条带明亮，无明显托尾，能满足作为 PCR 反应扩增模板的需要，见图 1。M.DNA marker; A.PBMC of healthy people; B.Hela cell; C.BEL7402 cell8图 1 基因组 DNA 凝胶电泳（略）Fig.1 Gel electrophoresis analysis of genome DNA22 HLAI 类基因在基因组水平拷贝数情况的鉴定利用特异性 PCR 引物进行 PCR 反应检测基因组水平 HLAI类基因的拷贝数情况，结果见图 2，Hela 细
15、胞和 BEL7402 细胞的HLAI 类基因（ HLAA、B、C）在基因组水平的表达与健康人PBMC 无明显差别。23 细胞总 RNA 提取鉴定从 Hela 细胞和 BEL7402 细胞中，提取出总 RNA， 1%琼脂糖电泳鉴定 。结果显示提取的总 RNA 有 3 条带，从上至下分别为 28 s，18 s，5 s，其中 18 s 和 28 s 这 2 条带的 RNA 亮度明显高于 5 s 带，证明 RNA 降解较少，所提取 RNA 质量较高，能满足下一步 RTPCR 反应的需要，见图 3。M.DNA marker; 1.HLAA gene of healthy people; 2.HLAA gene of Hela; 3.HLAA gene of BEL7402; 4.HLAB gene of healthy people; 5.HLAB gene of Hela; 6.HLAB gene 9of BEL7402; 7.HLAC gene of healthy people; 8.HLAC gene of Hela; 9.HLAC gene of BEL7402; 10.GAPDH gene of healthy people; 11.GAPDH gene of Hela; 12.GAP
