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1、 分枝杆菌林 徽 因李嘉诚汪涵哈佛李冰冰李 冰 冰俞敏洪概 述 分枝杆菌属（Mycobacterium） 是一类细长、直或略带弯曲专 性需氧性杆菌。无动力、无牙 胞、细胞壁含有大量脂质，该 菌一般认为革兰染色阳性。多 数细菌在生长的一定时期抵抗 酸-醇（acid-alcohol-fast）， 故又称抗酸杆菌（acid-fast bacillus）结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）n 简称结核杆菌n人和动物结核病的病原菌第一节 结核分枝杆菌复合群三个时期： 1882年结核菌被发现之前，称之为“白色瘟 疫”1882-1945年，发现结核杆菌到抗结核药物没有
2、 广泛应用前。1945年以后，进入现代化学疗法阶段1882年3月24日 世界著名的科学 家德国的 Robert Koch在 柏林发现并证实 结核杆菌是结核 病的病原体。流行病学全球疫情 1/3感染 新发900万/年 300万/年死亡我国疫情5.5亿感染者 估算有450万病人新发145万/年 65万/年传染13万/年死亡特点1.细胞壁含有大量的脂类2.菌体不易着色，不易脱色，故采用抗酸染色、又称抗酸杆菌3.无特殊结构，也不产生内外毒素。4.所致感染多为慢性过程n 结核分枝杆菌复合群（MTBC）包括人结核分枝杆菌（M.tuberculosis）牛分枝杆菌（M.bovis）非洲分枝杆菌（M.afri
3、canum）坎纳分枝杆菌（M.canettii）田鼠分枝杆菌(M.microti)等n前四种对人类致病，其中人型MTB感染率最高一、分 类流动人口的剧增耐多药结核菌的 出现人类免疫缺陷病 毒的蔓延二、临床意义WHO :世界仍处于 结核病严重威胁之中生物学性状1.形态染色：菌体细长微弯曲，有分枝，排列不规则，单个散在。易发生L 型抗酸染色阳性 2.培养特性： 专性需氧，最适温度375-10%CO2可促进生长 营养要求高，罗氏培养基（蛋黄、甘油、天门冬素、马铃薯、无机盐、 孔雀绿） 生长缓慢，18小时分裂一次，2-4周形成R型菌落，“菜花样菌落”，乳白 色干燥不透明，表面呈颗粒结节，边缘不整。 3
4、.抵抗力：含大量脂质，抵抗力强抗干燥、抗酸碱、抗化学消毒剂、对湿 热和紫外线敏感 4.变异性：结核杆菌易发生菌落形态（L型）、毒力（BCG）、免疫原性和 耐药性变异。致病性一.致病物质1.脂质：磷脂能促进使单核细胞增生，引起结核结节和干酪样坏死；分枝菌酸与菌体的抗酸性有关；梭状因子能破坏线粒体膜，抑制白细胞游走，引起慢性肉芽 肿 ； 蜡质D能激发机体的型变态反应；硫酸脑苷脂能抑制吞噬与溶酶 体的结合2.蛋白质：诱发变态反应3.多糖：与蜡质D结合能引起局部病灶的细胞浸润4分枝杆菌生长素：脂溶性的铁熬合物二.所致疾病： 1：原发感染：多见于儿童。常有肺门淋巴结大、干酪样坏死和结核结节 的形成，也可
5、经血到达多个脏器引起相应结核病。 2继发感染：多见于成人或较大的儿童，也以肺部多见，特点为病灶局限 ，不易累积邻近淋巴结，病灶常钙化而愈，也可破溃成空洞。 三、免疫性1.免疫机理：传染性免疫，主要是细胞免疫 2.免疫与变态反应：T细胞介导的结果n结核菌素试验（OT）： 原理：细胞免疫或变态反应。 方法：用OT或PPD所做的皮内试验 结果：阳性5mm红肿硬结直径2cm强阳性红肿硬结直径2cm； 阴性红肿硬结直径5mm 意义：阳性：已感染过结核，但不一定有结核病；强阳性：可能有活 动性结核病；阴性：未感染过结核，应排除感染初期或免疫力下降微生物学检验（一）基本特性n 结核分枝杆菌尚未发现产生内毒素
6、、外毒 素及侵袭性酶n致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖 引起的炎症、代谢物质的毒性以及菌体成 分引起的免疫损伤有关n结核分枝杆菌的致病物质主要是荚膜、脂 质和蛋白质三、微生物学检验（二）标本采集n据感染部位的不同采集不同的标本n疑肺结核：收集清晨第一口痰，清洁干燥的容器内送检n疑泌尿系结核：清晨一次全部尿量或24小时尿沉淀10 15ml送检，必要时作无菌导尿送检（诊断泌尿道结核通 常需35份标本）n采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,深部脓肿用无 菌注射器抽取送检n其他：无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌 试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取 凝块作涂片或接种培养三、
7、微生物学检验（三）标本直接检查 1.形态学检查 （1）直接涂片染色镜检 （2）浓缩集菌涂片检查法 2. 核酸检测 形态学检查n齐-尼染色（Ziehl-Neelsen technique） 是常用的抗酸染色法，染色后结核分枝杆 菌呈红色，背景呈蓝色形态学检查n用荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下 菌体呈橘黄色涂片镜检的报告方式半定量报报告石炭酸复红红染色：抗 酸杆菌（1000）荧荧光染色：抗酸 杆菌 （450） 未找到抗酸菌 可疑抗酸杆菌； 再送标标本检测检测0 12/300视视野0 12/70视视野119/100视视野218/50视视野219/10视视野436/10视视野319/视视野43
8、6/视视野49/视视野36/视视野n用PCR法快速诊断MTB感染nPCR法检测DNA特异性更强，敏感性更高nPCR须按法规要求规范操作，应防止标本污染出现 假性结果核酸检测三、微生物学检验（四）分离培养与鉴定 1.培养特性 n专性需氧n35CO2能促进其生长n营养要求高:须在含血清、卵黄、马铃薯、甘 油以及含某些无机盐类的特殊培养基上才能生 长良好。常用罗氏培养基n最适生长温度为3537，最适pH6.56.8n1418h分裂1次，在固体培养基上25周才 出现肉眼可见的菌落n典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透 明，乳白色或淡黄色，如菜花样2.分离培养n标本接种于选择性培养基中(常用罗氏，所
9、 含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长)n37，510CO2培养8周n结核杆菌出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落n涂片染色为抗酸阳性Bactec TB 960快速培养系统3D-120型三、微生物学检验（四）分离培养与鉴定 3. 菌种鉴定 (1) 生化反应 （2）噬菌体鉴定法（3）分子生物法菌种鉴定(4)高效液相色谱（HPLC）检测分枝菌酸 生化反应-烦琐、费时（ 48 周）,影响因素多n结核分枝杆菌不发酵糖类n能产生触酶n人型MTB能合成烟酸，还原硝酸盐，耐受 噻吩-2-羧酸酰肼，而牛型MTB则不能n人型和牛型的毒株中性红试验均阳性，无 毒株则为阴性，并失去索状生长现象噬菌体鉴定法（PhaB）n Wil
10、son 等于1997年建立的快速检测新技 术 n原理：是分枝杆菌噬菌体D29能感染活的分 枝杆菌,未进入感染菌体内的噬菌体被随后加 入的杀毒剂灭活 ,已进入菌体内的噬菌体不 受影响。噬菌体在感染菌体内大量增殖 ,并 将菌体裂解 ,释放出的子代噬菌体可感染随 后加入的指示细胞 ,并将其裂解 ,在琼脂平板 上出现透亮的噬菌斑。分子生物法菌种鉴定nPCR 限制性片段长度多态性分析（PCR- RFLP）nPCR单链构象多态性分析（PCR-SSCP）n核酸探针n核酸序列分析n多重PCR高效液相色谱（HPLC）n检测分枝菌酸：由于不同种的分枝杆菌细 胞壁中的分枝菌酸不同，所以利用HPLC检 测分枝菌酸可鉴
11、定菌种。 三、微生物学检验（五） 免疫学诊断 1结核菌素试验2结核分枝杆菌抗原检测 3. 结核分枝杆菌抗体检测 4. 全血干扰素测定法 结核菌素试验n针对旧结核菌素(OT)与结核菌素纯蛋白衍生物 (PPD)两种菌体蛋白n原理：当将蛋白注入皮内后，如受试者已感染 结核杆菌，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性 结合，在局部释放淋巴因子，形成迟发性超敏 反应性炎症，若受试者未感染MTB则无反应。结核分枝杆菌抗原检测n用ELISA 方法在血清中检测结核分枝杆菌 抗原-结核菌外分泌特异性抗原 (external secreted specific antigen) 浓度。n任何体液如血液、痰液、脊髓液、尿液
12、和 各式组织萃取液等体液可用于检测特异蛋 白抗原。结核抗体n作为活动性MTB感染的快速诊断方法之一n比传统的痰涂片抗酸染色、MTB培养等方法简便 、快速、敏感性高，但存在一定的假阳性。n近年，胶体金、蛋白芯片检查结核杆菌IgG抗体 抗体，特别是后者，针对三种抗原（脂阿拉伯甘 露糖、38K Da和16K Da蛋白质抗原），其灵敏 度和特异性均有所提高。全血干扰素测定法n原理：当全血与PPD和对照抗原（植物血凝素）共同 孵育后，致敏的淋巴细胞可分泌IFN-，通过检测 IFN-的含量来鉴定菌种。n2004年，Quantiferon-TB Gold assay 问世，应用 结核分枝杆菌RD1区域编码的
13、早期分泌抗原靶（ESAT ）和培养滤液蛋白（CFP-10）特异抗原刺激细胞检 测。n近来ESAT/CFP-10融合蛋白-ELISPOT用于诊断活动性 结核病，准确、灵敏、特异、快速。n结果与结核菌素试验相当，干扰因素小。（六）药物敏感性试验n将纯培养物菌悬液，接种含各种浓度药物的固体培养基上，同时做不含药物的对照组。n经过培养，含有药物的培养基上菌落数目是对照组的75以上，则认为该菌对该药物浓度为完全耐药，如无菌落生长则为敏感。三、微生物检验第二节 非结核分枝杆菌一、概述与分类二、临床意义三、微生物学检验一、概述与分类非结核分枝杆菌（ontuberculosis Mycobactericum，
14、NTM） :指结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、坎纳分枝杆菌和田鼠分枝杆菌) 和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。nNTM种类众多，现已被鉴定的有150余种, 包括专性寄生菌、腐生菌和中间型。n国际分枝杆菌分类研究组（IWGMT）分为 三类，即缓慢生长菌、快速生长菌和不能 培养菌三种类型。nRunyon按细菌产色素和生长速度将临床重 要分枝杆菌分为Runyon、群 概 述Runyon 分类类法群光产产色菌,如猿猴分枝杆菌、堪萨萨斯分枝杆 菌、海分枝杆菌; 群暗产产色菌,如苏苏加分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌 、瘰疬疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌; 群不产产色菌,如鸟鸟分枝杆菌复合群(
15、M1avium complex ,MAC) 、玛玛尔摩分枝杆菌、土地分枝杆菌 、溃疡溃疡 分枝杆菌、嗜血分枝杆菌;群快生长长菌,如偶发发分枝杆菌、龟龟分枝杆菌 、脓肿脓肿 分枝杆菌。二、临床意义n迄今为止已发现NTM有150余种，其中约 1/3与人类疾病有关。条件致病菌毒力低于结结核分枝杆菌自然界中广泛存在可以在人体某些部位定植n结核病和NTM感染的治疗不同 为为何要关注NTM？自然界中广泛存在，如水、土壤和气溶胶， 可导导致免疫力低下的患者感染。近年来，因手术术器械、注射器具及医疗疗用水 等灭灭菌不合格、使用不规规范造成患者手术术切 口、注射部位NTM感染暴发发事件。如：广东省某中心卫生院剖
16、宫 产患者手术切口感染事件。 该事件是由于手术器械灭菌不 合格导致的手术切口感染，病 原菌为快速生长型分枝杆菌。警钟长鸣NTM潜在杀手？ 卫生部关于严重医院感染事件通报 1. 关于深圳市某医院发生严重医院感染事件的通报2. 卫生部关于安徽省某立医院恶性医疗损害事件的通报 3. 关于西安交通大学医学院某医院发生严重医院感染事件的通报 4. 关于山西省太原某中心医院血液透析感染事件的通报 5. 关于天津市蓟县某院新生儿医院感染事件的通报6. 卫生部关于安徽省某县医院血液透析患者感染丙肝事件的通报7. 关于广东省汕头市潮阳区某中心卫生院剖宫产患者手术切口感染事件的 通报摘自江苏省卫生厅严重医院感染事件通报与处罚规定选编（ 2010年7月）光产色分枝杆菌（Runyon 群）n堪萨斯分枝杆菌（M.kansaii）：能引起肺内和肺外类似 结核样的病变n海分枝杆菌(M.mari
