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1、1三七茎叶中叶苷及黄酮的同步分离工艺研究【摘要】 目的探索分离三七茎叶中的叶苷和总黄酮的工艺条件及参数。方法以静态饱和吸附量、动态比吸附量、比洗脱量为考察指标，比较不同大孔树脂富集纯化三七茎叶叶苷和总黄酮的性能，并对最佳树脂纯化工艺进行筛选。结果 AB-8 树脂综合性能最佳，其吸附分离工艺条件为：上样液浓度为叶苷 1.806 0 mg/ml,总黄酮0.7852 mg/ml，上样液以 1.0 BV/h 吸附流速上样，纯水冲洗，60%乙醇洗脱后，再用 95%乙醇洗脱。结论经大孔树脂纯化后的三七茎叶有效部位中，总黄酮加叶苷的质量分数达 90%，说明该纯化工艺是可行的。 【关键词】 三七茎叶； 大孔吸
2、附树脂； 有效部位三七茎叶为五加科植物三七 Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen 的地上部分，三七叶苷及黄酮是三七茎叶中的有效部位。三七总黄酮与皂苷合用，生理活性最强，分开使用则证明总黄酮能显著增加心肌冠脉流量1 。现代研究表明，三七叶苷有延年益寿和增强机体活力的作用2 ；三七黄酮类成分具有增加冠状动脉血流、降低心肌耗氧量、抗心律失常、抗氧化、抗衰老以及增强机体免疫力等功能，具有治疗老年性痴呆症的可能，其在心脑血管疾病防治及保健等方面有广泛的应用前景3 。三七茎叶在三七道地产地文2山资源丰富，大约每年可收获 10 000 t，本实验以三七茎叶为原料，以提取物收
3、率（提取物质量/原料质量）和叶苷、总黄酮的纯度为考察指标，采用醇提-树脂法对三七叶苷及黄酮的提取分离与纯化工艺进行了研究，以期为三七茎叶的开发提供依据。1 材料三七茎叶购自云南文山三七国际交易市场；人参皂苷 Re 对照品购于中国生物制品检定所；AB-8 树脂为天津南开大学化工厂产品，HPD-100 为河北沧州宝恩化工有限公司产品， D101-大孔吸附树脂(华北地区特种化学试剂开发中心) ；其他试剂均为分析纯。岛津2550 型紫外分光光度计（日本岛津公司） ；DZF-6020 真空干燥箱（上海一恒科技有限公司） ，R201D- 旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司） 。2 方法与结果2.1 工艺
4、流程见图 1。2.2 三七叶苷的含量测定 22.2.1 标准溶液的配制精密称取人参皂苷 Re 对照品 0.020 0 3g 用甲醇溶解并定容至 10.0 ml，即每毫升含人参皂苷 Re 2.0 mg。2.2.2 样品测定精密吸取待测液 1.0ml 于蒸发皿，置于 60水浴挥干；同样精确吸取人参皂苷 Re 标准溶液 0.1 ml 于蒸发皿中，置于 60水浴挥干。在已挥干的蒸发皿中，分别准确加入 0.2 ml质量分数为 5%的香草醛冰醋酸溶液， 0.8 ml 高氯酸，混匀后移入5 ml 具塞刻度离心管中；于 60水浴加热 10 min，取出后用流水冷却，再准确加入 5.0 ml 冰醋酸溶液摇匀，以
5、 1 cm 比色池于 560 nm 波长处测定吸收值4 ，并通过下式计算求出含量。叶苷含量（mg/ml）=对照品量A 样/A 对样品体积式中：A 样，样品吸收值；A 对，对照品吸收值；对照品量，标准管人参皂苷 Re 的量 (mg)；样品体积(ml)。2.3 黄酮含量测定4采用分光光度计法测定总黄酮含量，即利用黄酮类化合物与铝盐反应，产生红色络合物，以芦丁为对照品于 500 nm 波长处测定吸收值。2.3.1 标准溶液的配制 5精密称取于 120 干燥至恒重的芦丁对照品 48.35 mg 置于 50 ml 容量瓶中，加乙醇溶解至刻度，4摇匀，精确吸取此溶液 10.0 ml 置于 50 ml 容量
6、瓶中，再加水至刻度，摇匀，即得标准溶液。2.3.2 标准曲线的制作精密吸取芦丁标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ，6.0 ml 分别置于 25ml 容量瓶中，各加水至 6 ml，再加入 5%的亚硝酸钠溶液 1.0 ml，混匀，放置 6 min，加入 10%硝酸铝溶液 1.0 ml，混匀，放置 6 min，加入 4%氢氧化钠 10.0 ml 再加水至 25 ml，放置 15 min（不加芦丁作空白对照） 。按分光光度计法在 500 nm 波长处测定吸收值。所取标准溶液的浓度和吸收度数据经回归处理，得回归方程：A= 0.219 6C0.011 2，其线性范围为 00.6 mg 相关系
7、数 r=0.999 3。2.4 上柱液的制备及预处理取干燥的三七茎叶，用 70%乙醇溶液为溶剂，料液比为 150（gml） ，回流提取 1.5 h，提取 2次，合并提取液，通过减压蒸馏回收乙醇溶液，得到的固形物用一定量的热蒸馏水溶解、过滤后作为样品溶液，总黄酮浓度为 1.570 4 mg/ml，叶苷浓度为 3.6120 mg/ml。2.5 不同型号树脂筛选2.5.1 大孔吸附树脂预处理先将树脂放在水中浸泡，除去浮在表面的树脂(反复几次) ，再用 95%乙醇浸泡 24 h，使树脂充分溶5胀，湿法装柱。用 95%乙醇以 2 BV/h 的流速通过树脂层，流至流出液加蒸馏水不变白色浑浊为止。再用蒸馏水
8、以同样流速洗尽乙醇。将 5%的盐酸溶液以 46 BV/h 流速通过树脂层，并浸泡 24h，然后用蒸馏水以同样流速洗至中性，再用 2%的 NaOH 溶液以 46 BV/h 流速进行碱洗，用去蒸馏水洗至中性即处理完毕。2.5.2 静态吸附试验由于三七叶苷和黄酮的极性较弱，根据相似相溶原理，弱极性的化合物更易被弱极性的树脂所吸附，故本实验选择 D101（非极性） 、AB-8（弱极性） 、HPD-100（非极性）作为备选树脂。在带塞的锥形瓶中，各加入取处理好的树脂 1 ml和 150 ml 上柱液于 25恒温摇床中，振荡 24 h，充分吸附后，过滤，取滤液，分别按“2.2” 和“2.3” 项下方法测定
9、样品吸附前后叶苷和总黄酮的浓度,按下式计算各种树脂的静态饱和吸附量(mg/ml 湿树脂 )。吸附量（mg/ml）=C0-CrW 树脂V式中 C0 和 Cr 分别为吸附前后提取液中的质量浓度 (mg/ml)，W 树脂为树脂的体积(ml) ，V 为溶液的体积(ml)。结果见表 1。表 1 树脂静态吸附结果（略）试验结果表明 AB-8、HPD-100 对叶苷及总黄酮静态饱和吸附6量均较大，D101 树脂对叶苷及总黄酮的吸附能力较小。2.5.3 树脂动态吸附实验比吸附量是评价树脂真实吸附能力的指标，是选择树脂种类的参数；比洗脱量是评价树脂解吸能力与洗脱剂的洗脱能力的指标，也是选择树脂种类及洗脱剂的参数
10、。本实验以比吸附量和比洗脱量为指标，对上述 3 种树脂进行筛选。将经预处理的树脂 30 ml，湿法装柱，径高比为 110，上柱液以 1.0 BV/h 流速上样，随时采用 FeCl3 乙醇溶液检测流出液，以 FeCl3反应变绿为泄露，停止上样，收集过柱液；纯水冲洗至流出液颜色极淡，然后用 95%乙醇洗脱，流速为 1.0 BV/h，洗至无明显 FeCl3颜色反应。分别收集各支柱子的洗脱液，定容，按“2.2”及“2.3”项下方法测定叶苷及总黄酮含量，计算比吸附量、吸附率、比洗脱量、洗脱率。结果见表 23 。表 2 总黄酮动态吸附及洗脱试验结果（略）比吸附量（mg/ml）=M 上-M 残-M 水洗 W
11、M 上为上柱液中指标成分的含量，M 残为流出液中指标成分含量；M 水洗为水洗脱液中指标成分含量；W 为树脂体积(ml)。吸附率（% ）=C0-CrC0100%C0 为上柱液指标成分浓度(mg/ml)；Cr 为过柱液中指标成分浓7度(mg/ml)。比洗脱量=M 洗脱 W；M 洗脱为洗脱液中指标成分的含量，W为树脂体积（ml） 。洗脱率（% ）=比洗脱量比吸附量 100%表 23 的结果表明，AB-8、HPD-100 型大孔树脂对叶苷及总黄酮的动态吸附量、洗脱率均较大，但综合比较可以发现，AB-8 树脂的综合收率（叶苷比洗脱量加总黄酮比洗脱量）最好，因此将AB-8 型大孔吸附树脂作为进一步分离纯化
12、三七茎叶中叶苷和总黄酮所用树脂。表 3 叶苷动态吸附及洗脱试验结果（略）2.6 纯化工艺参数筛选2.6.1 上样吸附参数的筛选上样浓度筛选：取处理好的 AB-8 大孔吸附树脂，湿法装柱，取 5 份上柱液，分别调整总黄酮浓度为 0.196 3，0.392 6，0.785 2，1.570 4，3.1408mg/ml ，叶苷浓度为 0.451 5，0.903 0，1.806 0，3.612 0，7.2240 mg/ml。以 1BV/h 流速上样，然后用纯水洗脱至颜色极淡，计算比吸附量。结果见表 4。表 4 上柱液8浓度对比吸附量的影响（略）从表 4 可以看出，AB-8 树脂的比吸附量随着上样液质量浓
13、度的增加而增高，当上样液质量浓度升高到总黄酮浓度 0.785 2 mg/ml、叶苷浓度为 1.806 0 mg/ml 时，AB-8 树脂的比吸附量趋于饱和。吸附流速的筛选：精确量取相同体积的上述项中确定的最佳上样液浓度的上样液 5 份，分别以 0.5，1，1.5，2，2.5 BV/h 对相同型号层析柱、相同体积的 AB-8 树脂柱进行吸附，然后用蒸馏水洗至颜色极淡，用“2.2” 及“2.3” 项下的方法测定叶苷及总黄酮的含量, 计算出比吸附量。结果见表 5。表 5 吸附流速对比吸附量的影响（略）从表 5 可以看出，随着吸附流速的增加，树脂比吸附量呈显著下降趋势，以 0.5 BV/h 和 1.0
14、 BV/h 的流速吸附效果基本相近最佳，考虑到工作量及工作效率等因素，以 1.0 BV/h 的流速吸附效果最佳。流速过快则树脂泄漏严重，有部分树脂吸附还未达到饱和就已经泄漏，吸附效果明显下降。但若流速过慢，工作量大且工作效率低。2.6.2 洗脱参数筛选叶苷与总黄酮的梯度洗脱：将总黄酮浓度为 0.785 2 mg/ml、9叶苷浓度为 1.806 0 mg/ml，上样液以 1.0 BV/h 流速上样达饱和时，用蒸馏水洗至颜色极淡，分别用10，20，30，40，50，60，70，80，90，100%的乙醇溶液以1.0 BV/h 的流速进行洗脱得不同洗脱液，用“2.2” 的方法进行测定叶苷含量；用“2
15、.3” 的方法进行测定总黄酮含量。结果见图 2。从图 2 可以看出，用 60%乙醇溶液可以把吸附在 AB-8 树脂上的大部分叶苷洗脱下来，再用 95%乙醇溶液（乙醇的一般商品规格）可以把吸附于 AB-8 树脂上的大部分总黄酮洗脱下来。但由图 2 可以看出：叶苷与总黄酮仍有一定的交叉，分析其原因：大孔树脂吸附原理主要为物理吸附，所以比表面积增加，表面张力随之增大，吸附量提高，对吸附有利。但树脂的实际应用是由树脂的极性、孔径、孔容及均一性的综合性能决定的。因此，出现此结果，可能是大孔吸附树脂的均一性差以及装柱效果不理想等因素所造成的。综合以上分析，采用 60%的乙醇溶液洗脱，富集以叶苷为主要成分的
16、三七茎叶有效部位(含叶苷 87.0%，总黄酮含量为 6.4%)；用60%乙醇溶液洗脱后，再以 95%的乙醇溶液洗脱，富集以总黄酮为主要成分的三七茎叶有效部位（叶苷含量为 13.3%，总黄酮含量为76.5%)。洗脱流速的筛选：根据上述的筛选结果，以 60%和 95%的乙醇溶液为洗脱剂，分别采用不同的洗脱流速进行梯度洗脱。结果见表106。表 6 洗脱流速对比洗脱量的影响（略）从表 6 的实验结果可以看出，当洗脱流速大于 1.5 BV/h 时，无论是采用 60%乙醇溶液，还是 95%的乙醇溶液进行洗脱，叶苷和黄酮的洗脱率均大幅度下降，故采用 1.5 BV/h 的洗脱流速进行洗脱。2.7 重复性实验采用上样液的总黄酮浓度 0.785 2 mg/ml,叶苷浓度为 1.806 0 mg/ml 的质量浓度上样，以 1.0 BV/h 的流速吸附，用蒸馏水洗至颜色极淡，以 60%的乙醇溶液为洗脱剂，洗脱流速为 1.5 BV/h，洗脱直至 Fe
