氨基酸纸层析

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1、*1实实 验验 一一氨基酸纸层析氨基酸纸层析*21、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层 析的原理和操作技术；2、掌握分配层析法；3、掌握影响分配系数的因素。一、实验目的：一、实验目的：*3层析技术层析技术( (chromatographychromatography 色谱技术色谱技术) )一、发展史：层析分离技术在20世纪初就已得到应用：1903年用于植物色素的分离,各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体；1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析；20世纪六十年代末出现了高效液相色谱(HPLC)。*4二、定义层析技

2、术是根据被分离的混合物中各组分的理化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中进行分配。层析的基本概念*5l 固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固 体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可 以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液） 。l 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的 物质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析 中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。层析的基本概念*6三、层析技术的种类l1、按流动相的状态分类：（1）液相层析（色谱） （2）气相层析（色谱）；l

3、2、按固定相的使用形式分类：（1）柱层析（2）纸层析（3）薄层层析；l3、按分离过程所主要依据的物理化学性质分类：（1）吸附层析 （2）分配层析 （3）离子交换层析 （4）凝胶层析 （5）亲和层析等。*7纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。 将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点二、实验原理二、实验原理: :*8分配层析法：利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系

4、数不同，而达到分离目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数。溶质在固定相的浓度(Cs) 分配系数=溶质在流动相的浓度（Cl)*9溶剂系统： 正丁醇：甲酸：水=15：3：2 固定相：水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相;流动相：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。由于混合液中各种氨基酸的值不同，所以移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。*10移动速率(比移值)：原点到层析点中心的距离Rf =原点到溶剂前沿的距离*11影响Rf值的主要因素：Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积

5、比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物质分配系数不同，Rf也就不同。（1）物质的结构和分子极性：物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间的分配系数，极性大的易溶于水中即固定相中，Rf小；反之,Rf则较大。*12（2）层析溶剂：首先，溶剂的纯度要高。其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的Rf在0.050.85。 再次，溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇- 甲酸-水系统久放易引起酯化。（3）pH值：溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离，从而影响物质 的极性和溶解度，使Rf改变；*13（4）滤纸：层析

6、滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁， 质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的 机械强度，要被溶剂所饱和。不同型号的滤纸，其厚 薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合 水的量不一样，两相的体积比也就不同，Rf也不同；另外，滤纸的杂质也会影响Rf，必要时进行预处理（可用0.010.4M的HCl处理除去金属离子）. *14（5）室验室的温度和时间:温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用从而影响固定相的体积；也影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。层析必须在恒温条件下进行。*15（6）展开方式：上行法Rf小；下行法（层析缸上部有一盛展开剂的液槽

7、，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易扩散） Rf大；环行法（最好用无方向性的特制滤纸）用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf较小。（7）样品溶液中杂质：如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。*161、实验材料：谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品 2、仪器：(1)毛细管 (2)电热吹风机 (3)层析缸 (4)层析滤纸(5)小型玻璃喷雾器(6)铅笔、直尺等。 3、试剂：(1)氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、 组氨酸标准品。(2)溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀； (3)显色剂：0.25%的茚三酮丙酮溶液。 三、实验材料、仪器和试剂：三、实验材

8、料、仪器和试剂：*171、样品的准备：称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品各 1mg混合溶于10%异丙醇中，0.01M。 2、滤纸的准备： 取一长方形滤纸，在滤纸横向对应的两边，距边沿 2cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点 样线，在点线上每隔2cm画一个“+”作为点样位置，共5 个点。四、实验步骤：四、实验步骤： *18*193、点样：用毛细管点样，中间点混合氨基酸，两侧点四种标准氨基酸；每个，每点一次用晾干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左点样点重复点5次右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外。 *20*21*224、展层：向层析缸中加入层析溶剂，液面不要超过

9、点样线，（高约1.5cm，约50ml溶剂）将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出冷风吹干。5、显色：用喷雾器将0.25茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，热风（加快反应）反应吹干显色。*23五、实验结果与计算： 1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种已知氨基酸和未知氨基酸的Rf值。3、分析混合样品中未知氨基酸的组分。*24*25六、思考题：六、思考题：1、分析影响分配系数的因素有哪些？2、何谓分配层析法，分配系数？3、 茚三酮丙酮溶液的作用机制？茚三酮丙酮溶液的作用机制？七、七、思考题答案思考题答案l1 、答：质量比和pH都有影响。 当萃取 剂浓度、组成、水相成分以及温度等改 变时，分离系数就要发生变化。 *26七、七、思考题答案思考题答案l2 、答： 利用不同组分在流动相和固 定相之间的分配系数不同,使之分离。被 分离物质在两相中都能溶解，但分配比 率不同，展层时就会形成以不同速度向 前移动的区带。 指一定温度下，处于 平衡状态时，组分在固定相中的浓度和 在流动相中的浓度之比，以K表示。 *27七、七、思考题答案思考题答案*28l3 、 氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共 热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮 ，再与水合茚三酮反应生成紫红色，最 终为蓝色物质。脯氨酸等仲胺氨基酸与 茚三酮反应生成黄色物质。