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1、中山大学硕士学位论文胰岛素对谷氨酸诱导PC12细胞损伤的保护作用及机制研究姓名：姜寿峰申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：边连防2003.5.21中出大学硬士论文串变羹蔓胰岛素对谷氮酸诱导P C I 2 细胞损伤I 骢僳护律用及机制研究研究专波；神经病学 硕士轿究生；姜海峰 撵导数l | l | ；逸连跨主程薮耀中文攮要 豁篓( 酸盼兴资避粹经毒性燕缺赢性脑瞧营蒺爨研究中黪一个鬟要盼方蘑。塔t 往瓣磷突多试蔻懿酸耱兴套毒瞧蹲致壤鼹强亡黪方式是舔惩。嚣裁越来邃多静研究表羁谷氮酸哥以诱导缨黪凋亡，本安验利翔谷鬣黢诱导P C I 2 缨腺壤饶模型验诞谷懿酸诱导凋亡的作鞠，并进行胺蕊素神经傈护的
2、研究。避1 0 筝来大壁瓣实验骚究袭鳃麟薅索其纛静经保护终矮，具有多方霆的终矮枫蠲。著试隽骧箍索鹣在藏袋盘羧襄骆瀵中麓箨爆并不援较袋子荬簿巍糖瓣 髻惩，受发现胰岛索矮脊中枢神经系统的畿接的辛率经傈护 乍粥。本实验攒鼠粥亡的角度，对麟怒素在谷氨漱诱导P C I 2 细胞撰饶模型上进行进一拶的搽讨。 零鹾究蒜翼瓣；1 、验透谷懿羧诱譬P C I 2 缀魏臻魏模溅。2 、露隗骥邀囊露谷爨羧 诱导P C I 2 细胞损伤保护作用及与凋亡的关系。3 、从胰岛素受体分予信号传导角度，孵确胰岛豢对谷氮羧诱等P C I 2 缁臆损伤保护律稍的视青l 研究。章孝辩每方法： 僚护箨耀臻显，程统诗掌上窍显著意义。3
3、 ，3 1 ) N A 毫澈努凝霆鬻缨蕤缍蕤D N A 虢龛整，不能逶避T r i t o n 1 0 0 ( 缨麓裂簿滚鹣袋努之一l S 中山大学硕士论文第3 章一) 的细胞膜打孔被抽提出来，而凋亡的细胞的D N A 链以核小体为单位被切割降解，可以通过膜上穿孔被抽提出来，并可以在凝胶电泳上呈现以1 8 0 2 0 0 b p 为间隔的梯状条带。通过琼脂糖凝胶电泳图象( 电泳图见附图9 ) 可见谷氨酸组、胰岛素2 0 0 m u L 、l O O m u L 出现“D N AL a d d e r ”而胰岛素4 0 0 m u L 和正常细胞未见“D N AL a d d e r ”。3 4
4、 A k t 蛋白表达通过S D S P A G E ( S D S P A G E 图见附图1 0 ) 可见胰岛素组( 4 0 0 m u l 、2 0 0 m u l 、l O O m u 1 ) A k t 条带均明显比谷氨酸组A k t 条带粗，同时也比正常细胞组粗。反应了胰岛素组P C I 2 细胞A k t 表达比谷氨酸组和正常细胞组P C I 2 细胞A k t 表达的多。以上结果说明胰岛素可以促使P K B A k t 蛋白表达的作用。而谷氨酸组未见促使P K B A k t 蛋白表达的作用。由于本实验是每组细胞同样条件下进行检测，且有正常细胞组的对照，因此认为胰岛素可以促使P
5、 C I 2 细胞的P K B A k t 表达。胰岛素的抗凋亡作用可能与此蛋白的表达有关联。1 6 中山大学硕士论文第4 章第4 章讨论毛1P C I 2 缩藤在神经科学研究审的寂焉P C I 2 ( p h e o c h r o m o c y t o m 8c e l t s ) 绷施系舔嗜铬缩簏瘤缅脆壳隆，是酲前广泛丽来研究神经编胞功能、分化发育和死亡的一种缁脆培养模整。P C I 2 绣稳是最早予1 9 5 7 年经辐射大鬣肾上豫髓痿瘩中移禳出静稀释癣细稳，著经过连续荜蘑培养而获得的细魏秣。P C I 2 维稔作爻一释，L 茶酚胺类缩藏，英稳质中含有大量的曦铬鬏粒，茹嗣不会N G
6、F 静培养基培养，P C I 2 缩藏表瑗出增殖鬃施懿一些特性，警在培养蘩中翻入N G F ，剐可使之分纯为分泌去甲鸶上艨素豹非增莛缨腱。在寿黧长瀚子存在鑫孽涪莽条件下P C I 2 缩胞霹分化梵交惑神经元缀藏，使箕在形态、生理及生纯功能等方磷更接近予聿率缀元，P C I 2 缩艟落嚣酵具备有享聿经雨分泌细臌和神经元静槛震，困j 毙被广泛箱子襻经元死亡方式帮神经毒理静研究。“。又因为来潦于大鬣臀上豫髓震嗜铬绍稔瘩缁缒钓P C I 2 缀貔易予稳定培养、易获褥链帮缀瀣均一骸等饿点，蠢成为享牵经秘学离髂研究中静蓬要缁胞，普遍焉来研究享搴经元豹工兵缁貔。本安验中瑷至l 熬P C I 2 缨熬是经过E
7、 G F ( 表皮生长毽予) 一诱导分纯懿维藏株。4 。2 谷氯酸擐爨模羹谷氨酸是中枢襁经系统中豹秘蓬要鹣兴鸯性季睾经递厦，是弦缀织中含量较裹戆一嵇熏要爨基酸，在人类大藏皮屡中达9 l l u m o l g ，在臆痰豹分枣摆当广泛。生理状态下，怼齄维持菠常瓣生理功缝起刭重安静作用。正掌攮汉下，它主要存农于享孛经束攒谷氨酸囊溆中，在艟缺斑缺氧时，可导致亭孛经元能量代谢障碍，抑制鲴骢膜、N a 匕K + - A T P 薅的活动使缨胞钤K + 浓度唆显丹毫，_ N a + 浓度相应降低，1 7 中山大学硕士论文纂4 章导数细胞去极化，去极化引怒兴奋性神经末梢中的铸氨酸囊泡外排，同时胞外高K+ 髓
8、够逆转签爨黢嵩装j 疆瞧转送体鳃溪动，把蛰懿酸从突触露糖经寒麟鹣藏浆孛运输至细胞辨，弓| 起所谓“不依赖钙离子的菲囊躲性释放”。缨胞外间隙巾的谷氨黢浓度迅速升蕊，同时伴脊谷氮酸摄入机制障碍，使细胞外铸氨酸进一步升高，势遴一多裁激貉氮黢懿释黢，往缨琵终豹谷氨羧浓度遘凌罐离，魏对缫藏辨谷氨馥的浓度可逡剩5 0 0 u , l m o l L 。通过谷氮酸受体形成一系列级联放大效应，产生神经兴套毒性，激终导致缨臆死亡。2 ”1 。关予谷氨羧戆兴套性鬣鏊羧毒睦，避鏊蠹努软巍注藏举审颁域磷究靛热煮，越铸氮酸的程体鞠离体都进行了大量的研究，观察谷氨酸对神经细骢损傍豹机制，磷究毒牵经缨臆熬延亡方式。程谷氨酸
9、鬻体损伤模溅中，国杰井对谷氨酸诱鼯缀脆损伤丽使周的剂爨也有不阍静报道，褫盈因为谷氮酸作用懿缨鼹释类不弼( 大赫皮鼷细胞、小脑颗粒细胞、海马细胞、P C I 2 细胞等) 、作用持续时间的不同( 5 m i n 、l O m i n 、1 5 m i n 、2 0 r a i n 、3 0 r a i n 、l h 、2 4 h 等) 、实验方法葶馨羧溺凋亡方法熬不弱、翼为熏要的怒谷氮酸使用剂援的不同使得不同研究中谷氨酸损伤模型也不同。正常愤况下，享申缀元和神经胶质细胞可以维持细胞铃谷氨酸的浓度在I S u m o l L ，稀密体实验诞实在缺搬时，瘵予谷氨浚的释放蹭麴霹再摄敬簿碍，导致缁臌舞谷
10、氨酸的水平可以达到l O O u m o l l 。在体外实验中有用2 0 0u m o l L 、5 0 0u m o l L 、I m m o l 屈、3 t “ , t m o l L 等不霹熬裁量诱露鬃戆懿缓镑随“。凌蠢磅突者馁麓低浓溲3 0 u m o l L 谷缀酸成功诱导了体外培养皮层神经细胞、小脑颗粒细胞及胶旗细胞瘤缨鼹凋亡”“。誊瓯寒鼹滚认为谷氨激鹣兴奁毒犍作雳後缀藏死亡鹣方式是急瞧戆缎魏霉性即袭现为坏甄，然而近年来关于谷氨酸诱导细胞凋亡的报道也越来越多，不只攀| 怒缨纛熬璐獯；然露越来越多豹摄逶认菇谷氨羧瓣兴奁毒魏霹默诱等凋亡发生。大鬃察验表翳，在谷氨酸的介譬静神经镪施损伤
11、中溉有急瞧瓣镏骢蟒叛襻农，又肖迟发糕的细腻凝亡，即细胞的凋亡存在0 7 ”。产生戬上争议瓣骤毽从实验本身霹戳整结势必以下足方露熬器毽：燕骏方法与模型不同，肖的是动物实验，有的是离体培养选用的观察对象不同，有的实验用小脑颗粒细胞，有的实验用皮层神经元或海马神经元等觋察细臆凋亡鲍一1 8中山大学域士论文纂4 章时间昶方法不同，两且观察的时间点不同选用驰谷氨酸豹浓发不阔，这也是最霪簧黔一袈。歪象L e i s t 麓脚3 艇谥舷绸魅孺亡类型取决于刺激的瞧震秘强度、缨鼹酶类鼙稻缁飚在垒静弼裁中瀚阶段。有学潸从谷氨酸受体的角腱对谷氨酸的兴鸯毒性诱导的死亡方式进行揲讨，认为可馥潋急瞧缀藏嚣孛联或蠹延迟瞧鲴
12、胞延亡( 凋亡) 魂秘方式进行：急瞧缨照瓣强熟枫耀是酬融帮K A 受体激滔酵突舷后耱缀茬去极化_ j 薅受体开赦过程中慕a +大藿舂流，继发e l 一耪寒分的蠢瀛，健裤经元严重永静，迅速渍交琵亡所谓快速海性过程。而延迟憔细胞死亡( 凋亡) 主要是由N M D A 受体激活时钙离子内流以及代滏蘩答懿馥受俸激活霉 超戆缨旋瘫锈释拔，怒缝蕤凌锈浓疫舞毫，锈离子臻海蕊臻的缯艨走瓣第= 信搜可激淫各转蹲勰酶包括磷滕酶e 、磷脂酶A 2 、钙激满神经龙虽鑫黪l 强I I ( c a t p a i nl ，I I ) 、P K C 、N O 台残酶、孩黢蠹韬释、黄漂泠氧化酶等，破坏神经元的脂质膜、细胞骨架
13、强白、核酸的重要成分，诱蜉细胞凋亡的发生3 。本实骏孛通过颈实验并缝合文献摄暹，采用0 5 m m o l L 麓签羹鼗穆惩2 0 m i n蒂l 造P C I 2 细臆酶损伤模型，蹬在诱导谷氨酸掇俊楱受中趣瑷糯亡，蕊避免谷鬣酸剂量遥大，作用时阊过长而导致P C I 2 寝现为以急性细胞死亡即坏死的损伤模型，以方便观察胰岛素对P C I 2 凋亡有无保护作用及其机制研究。本实验通过检测凋亡秘硷溪缨魏活力霹个方蠹黠昝氮酸诱导P C I 2 蘩熬缓袋模婆 遴行译徐。通过鬣嚣耀差嚣羧镜、F D A 染琶稻H o e c h s t 絷色“荧毙显微镜下的形态学蕊察，谷氨酸作用组与正常组比较，豁氨黻组细
14、胞2 4 h 观察；细胞缩小，变灏，细麓突起臻照减多、绥短，湾失。活缨爨数鹱曼减少，缝熙鼗落、鼗农，窭蕊麓亡纲脆，受攒缩脆形态学差异十分瞬显。觚形态学诚实谷氨酸对P C I 2 缩脆损伤横溅熬建立。逶过D N A 臻l 翼糖凝获毫濠分掇，可是巍答氨酸缀觅委l 鬃藏攥亡熬稳程瞧电泳结果：D N A 梯状条带。证实谷氨酸对P C I 2 细胞可诱导凋1 亡。凇 实验是捻溅缀胞活力韵龆窦有效熬实验之一。Y T T 憝一穆疆躞撩，它可被溪跃懿维稳摄取，在缨蔻震线粒俸壤稿酸脱惑酶静苄筝瘸下，转变为蓝色的f o r m a n z a n 产物，并淡积在细胞中，面歹旺细胞无戴幼懿。用二甲基亚联( D M
15、S O ) 溶一l 中山大学硕士论文第4 章液，溶液终止M T T 反应，并充分溶解其蓝色的f o r m a n z a n 产物，然后测定每个样品的光密度值( o D ) 值，其O D 值直接反应活跃的细胞的数目“，其灵敏度高，重复性好。本实验将M T T 比色实验的o D 值作为细胞活力监测的一个观察指标。也用来评价谷氨酸损伤模型的建立和胰岛素的保护作用。从本实验看，谷氨酸组和正常组比较，谷氨酸组的o D 值F s ) 为0 2 0 1 0 0 7 9 ，正常组o D 值( - s ) 为0 3 2 61 0 0 7 9 ，两组比较P 值一4 3 圭坐盔堂堡圭堡奎曼曼BC秒弓M图9P C
16、 I 2 细胞D N A 琼脂糖凝胶电泳分析A N o r m a lc e l lBI n s ( 4 0 0 m U l L ) CI n s ( 2 0 0 m U L ) DI n s ( I O O m U L ) EG l uMM a r k e r一4 480圈1 0P C I 2 缀艟A k t 蛋白表达水平的影响气I n s ( 1 0 0 m U L )DN o r m a lc e l lBI n s ( 2 0 0 m U L )EG l uCI n s ( 4 0 0 测L )鬻阳性样黯对照一4 S 一中出大学硕士论文囊纛致谢衷心感谢尊敬的导师逸连防主任医辩三年来对本人的悉心指学和热情关怀，感谢边老筛对本课题麴设计及宪戒给予大燕静指导与一支持，感谢边老癖对我磷究生学习期阂在学习秘生活各方嚣的帮助秘照灏!衷心感谢本科室主任胡学强教授对我奁临床和科研方西的谆谆教静和热心支持l 非常感谢陈晓缎、伍爱民、陵正
