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1、肠缺血/ 再灌注所致急性肺损伤过程中N O S 的变化及其意义中文摘要 目的: 研究小肠缺血/ 再灌注引起急性肺损伤过程中，内皮型一氧 化氮合酶 ( e N O S )及诱导型一氧化氮合酶 O N O S )的表达，了 解其时相变化和在急性肺损伤发生中可能的作用。 材料与方法:S D大鼠，阻断肠系膜上动脉 ( S M A ) 6 0 m i n ， 根 据不同再灌注时fl随机分为A ( 6 0 m i n ) , B ( 1 2 0 m i n ) , C ( 2 4 0 m i n ) 组。 A C , B C , C C组分别为A , B , C组对照组， 行剖腹术但不 阻断肠系膜上动脉。
2、 术中监测平均动脉压 ( N W ) . E v a n s 蓝法测 定大鼠 肺毛细血管通透性以判断肺漏出变化、逆转录聚合酶链式 反应 (R T P C R ) 法测定肺一氧化氮合酶 ( N O S ) m R N A表达、 W e s t e rn 印迹法测定肺组织N O S 表达，同时进行小肠组织学检查 以评价肠损伤程度。 所得数据应用A N O V A分析进行统计学处理， 结果以均数士 标准差 ( x 士S D) 表示。 结果:开放S M A后，M A P 在一段时间内 有所下降。随持续生理 盐 水 ( N S ) 输 注， M A P 逐渐 恢 复 正 常。 肺E v a n s 蓝
3、含 量 ( n g / m g 湿重组织)测定，结果显示:与对照组相比，其含量于各试验组 明显增加， A / A C 组: 2 2 9 .8 2 1 1 8 . 1 3 / 1 9 8 .0 0 12 2 . 1 7 ; B / B C 组: 2 7 4 . 1 2士2 5 .4 0 / 1 7 8 . 4 8 士2 0 . 3 1 ; C / C C组:2 6 9 . 8 7 士2 0 . 9 3 / 1 9 5 . 6 8 士1 0 . 9 9 0 此外A组与B 组间差异显著， p 试验发现出血性休克和复苏后肠系膜淋巴结及 P e y e r 氏 体中 前炎 性因 子和免疫 调节细胞因 子
4、的m R N A表达明 显 增强。T N F a水平与肠缺血时间正相关。I L - 6主要释放到全身循 环而不是肠腔。 这种细胞因子反应数量可被肠道内过度生长的细 菌所增强。肠上皮细胞也能够阻止炎性反应的表达。肠上皮细胞 和巨噬细胞共同培养可阻碍巨噬细胞释放炎细胞因子 T N F a 。其 过程是主动的，耗能的。清除肠上皮细胞内能量储存后可以消除这种抑制。 .C u z z o c r e a 等 2 2 发 现在 缺少I L - 6 基因的 小鼠 中 可明 显降 低P 选择素和I C A M - 1 的密度和程度。明显降低中性粒细胞渗出 进入 再灌注的肠道，降低髓过氧化物酶 MP O )的活
5、性，减少过氧化 氮的形成， 减少M D A水平和增强生存率。 表明I L - 6 在缺血/ 再灌 注损伤中 起重要作用。 阻断I L - 6 可以 减轻损伤的机制部分是由于 阻断了 粘附分子的表达和中性粒细胞介导的细胞损伤。S u n 等 f2 0 . 2 1) 发 现 应 用 血 小 板 活 化因 子 ( P A F 贻抗剂L e x ip a f a n t 可以明显减轻肠缺血/ 再灌注引起的肠道双向通透性的升高。 同时 可以减轻肺和肝脏的白 蛋白 漏出， 减少由 缺血/ 再灌注引起的I L - 1 和I L - 6的 释放。 表明P A F在缺血/ 再灌注介导的肠损伤中有重要 的作用并引
6、起远离脏器的 损伤。可能是通过诱发内皮和上皮屏障首都医科大学硕士学位论文文献综述功能损害引起。P A F还可能部分引起蛋白酶一 抗蛋白酶系统的活化。 2 .2 . 3内 皮素p 5 1内 皮素 一 1 ( E T 1 ) 是内 源性多 肤， 具有强烈的收缩血管作用， 主 要来源于血管内皮。 其前体大E T 1 在内皮素转化酶的作用下分解 并作用于两种受体: E T - A和 E T B 。前者位于血管平滑肌，后者 位于血管平滑肌和内皮细胞。 血管平滑肌细胞上的受体 E T A和 E T B负责血管收缩，位于内皮细胞上的E T B通过释放N O和前 列腺素引起血管舒张。在不同的脓毒血症中己经发现
7、有高浓度的 血浆E T - 1 样免疫 反 应物 ( E T 1 - L I ) 并且与 脓毒血 症病人的 并发 症发 生率和死亡率有关。 基于上述原因， E T 1 有可能在脓毒血症性休 克中 影响内 脏血流 及其分布。 在非脓毒血症大鼠 中 灌注E T 1 可导 致肠系膜血管收缩，而用 E T受体拮抗剂可有效防止其作用。另 有动物试验表明， 内 皮素可增强内 毒素介导的菌群移位。 利用E T 受体拮抗剂B o s e n t a n 可恢复猪模型中由内毒素休克引起的门 静脉 血 流下 降， 成 倍 提高了 氧 输 送， 明 显 改 善 肠 粘 膜酸中 毒 15 ) . W o l fa r
8、 d 等0 6 1 发 现无论是全身应用还是移植肠道局部灌注内 皮素受体拮抗 剂都可以减轻缺血/ 44灌注对犬自 体小肠移植损伤。内皮素在肠移 植过程中与缺血再灌注后血液动力学有关并引起损伤。内皮素拮 抗剂可用于减轻肠缺血。 体外试验显示上调 E T 1的表达和产生 E T 1 要数小时。 体内 试验中， 静脉注射大剂量的内毒素可在5 - 1 0 分钟内 导致大鼠 血压明显下降，该效应可由内 皮素拮抗剂阻断。 很明显，这是高剂量内毒素的直接作用。当给小剂量内毒素后， 由于内毒素的间接作用， 血浆E T 1 在数小时后上升。 动物模型中 由内毒素引起的E T 1 升高可因抗T N F a 的使用
9、而下降。 表明这种 间接作用很可能是通过释放细胞因子， 特别是T N F a 和I L - 1 引 起 的。在人脓毒血症性休克中，循环T N F a 和E T - 1 有明显的关系。硕士学位论文文献综述2 .3 P MN与肠缺血/ 再灌注损伤肠缺血/ 再灌注损伤的首发效应是由通过黄嗓吟氧化酶产生 的活性氧自由 基代谢引起的。 随后的更多的氧代谢反应可由P MN 中N A D P H氧化酶的激活引 发。 肠粘膜中有大量的黄嚓吟脱氢酶， 其生理功能为嗓吟代谢。 然而， 经过6 0 分钟的缺血， 黄嚓吟脱氢 酶在钙依赖的蛋白 水解酶过程作用下转变为黄嗦吟氧化酶。产生 的分子物质如超氧化物， 过氧化氢
10、，轻自由基等通过直接途径或 激活循环中的 P U N对粘膜造成损害。 谷胧昔肤是细胞内 重要得 氧自由基清除剂。其生物合成部分依赖于谷氨酸。充足的谷氨酸 供应可以维持缺血/ 再灌注损伤期间大鼠 肠粘膜谷肤昔肤水平， 减少细胞膜脂质过氧化。T N F 被认为是多脏器损伤的始动因子。它可通过激活中性粒 细胞上调粘附整合素一 C D l l b / C D 1 8 复合物，后者与内 皮细胞源性 的 细胞间 粘附 分子 一 1 ( I C A M - 1 ) 结 合， 增强中 性粒细胞与内 皮细胞 的 粘附 1 7 1 ， 低剂量的T N F 即可引 起肺内P M N的滞留。H o ri e等f ig
11、 ) 通过对基因突变小鼠( 分别缺少 I C A M - I . C D 1 1 / C D 1 8 ) 和 敲除P 一 选择素 基因鼠 进行 研究发 现， 上 述小鼠 在小 肠缺血巧分再灌注1 小时后肝脏内白 细胞聚集反应明显低于野生 型小鼠。说明白 细胞一 内皮细胞粘附在小肠缺血一 再灌注后肝脏功能失调中起重要作用。氧化反应刺激肥大细胞释放颗粒是趋化 P MN进入小肠的关 键步骤。肥大细胞释放多种炎性介质包括组织胺、血清素、细胞 因子、P A F和白三烯。缺血/ 再灌注后由血管内皮细胞产生的N O 减少或消失，导致内皮细胞粘附因子的上调， 特别是P选择素， 增加了内皮细胞对P M N的粘附
12、。 P选择素拮抗剂可以阻断P M N 粘附， 减 轻由P M N 引 起的 损 伤。 内 皮细 胞 粘附 分 子 ( 如P 选择 素、 E选择素、 I C A M - 1 ) 的表达受前炎性细胞因子如T N F a和I L - 1 的首都医科大学硕士学位论文影响。 P M N通过氧爆发和释放金属蛋白 酶如弹力蛋白 酶和髓过氧 化 物酶 造 成 组 织 损 伤。 M a c - 1 ( C D 1 1 b / C D 1 8 ) 是P M N表 面B 2 整 合 素受体。与紧急情况下粘附引起的氧爆发有关。其单克隆抗体可 起到对缺血/ 再灌注损伤损伤的保护作用。 P A F 是P L A 一代谢的
13、产 物，可诱导P MN表达C D 1 1 b 。缺血/ 再灌注小肠可产生P A F ，具有趋化作用并激活P M N产生活性氧代谢物12 1缺血 再灌注可增强细胞细胞 粘附分子 ( C A M ) 表达。 用内 皮细 胞C A M的 单克 隆 抗体阻 断可 减轻白 细胞聚集现象 19 1 。 单层内 皮 细胞受缺氧/ 再氧化的影响，可增强不同粘附糖蛋白的表达， 包括 E 选择素和细胞粘附 分子1 ( I C A M ) 。 表达需数小时 才能达到高峰， 表明其受转录调节。体内 环境下，缺血后组织肥大细胞和巨噬细 胞释放细胞因子作用于内皮细胞，可上调C A M表达。 肠缺血/ 再 灌注可导致上皮细
14、胞损害， 细菌及其代谢产物如L P S 进入粘膜间 质，与巨噬细胞表面受体结合，也可刺激释放细胞因子，作用于 微血管内 皮细胞， 增强其C A M表达。有实验表明外源性L P S 增 强小肠内皮细胞 C A M表达，内源性 L P S在缺血/ 再灌注引起的C A M表达中无明显作用。 2 .4肠缺血/ 再灌注损伤与肠上皮细胞凋亡成年小鼠小肠上皮更新是动态的连续过程。上皮更新速度平 均6 0 小时。 肠粘膜上皮的更新局限于L i e b e r k u h n 隐窝。 该处所有 的上皮细胞都起源于隐窝基底部的多能干细胞。干细胞经过 4 - 6 代分 裂后， 形 成C y c l 吨 t r a
15、n s i t 细胞， 位于隐 窝中 部。 随 后， 来源 于干细胞的上皮细胞移行到相邻近的绒毛，进一步分化成为吸收 性肠细胞( 占上皮细胞的 8 4 % ) 、粘液细胞和肠内分泌细胞。从隐 窝到绒毛项部大约需要 2 - 5天时间。到达绒毛顶部的细胞通过凋 亡或脱落形式更新。 从干细胞层移居并存在于隐窝底部约2 0 天。小 肠上皮凋亡可分为 3个阶段。 ( 1 ) 诱导阶段，依 赖于信号鱼 塑 丝 竺 迥 兰 坐 丝 二 一 一 一 一 一 一 一的传导及诱导刺激的性质。 ( 2 ) 递呈阶段，至少部分依赖于细胞 色素C从线粒体转移到 胞浆。 ( 3 ) 终末执行阶段， 细胞死亡并呈 现特有的
16、病理学变化。终末期在进化过程中有高度的保守性。且 在 1 小时内完成， 伴随细胞蛋白 质的降解。 B c l - 2 基因控制细胞程 序化死亡， 增强B c l - 2 或其相关蛋白 质产物B c l - X L的表达可阻断 致死性刺激后细胞色素C的易位。 相反则增强B a x 启动子的易位。 细胞色素C 结 合A p a f - 1 和p r o c a s p a c e - 9 。 在d A T P 存在的 情况下， 产 生 激活 态的C as p a c e - 9 ， 激活 其 它的C as p a c e ， 并 引 起 其 底 物 水 解。 提示B c l - 2 及其家族的功能是通过防止或延迟释放细胞色素C 来 抗细 胞 凋 亡。 所以 ， B c l - 2 影 响 凋 亡的 第2 阶 段 ( 递 呈阶 段 ) 。 这 个延迟的过程使得细胞能够有机会作出其它反应避免死亡。肠缺 血时间和细胞凋亡程度间 成正比 12 4 1 , 0 - 5 0 分缺血导致凋 亡指数增 加5 倍。 用C a s p a c e 抑制剂Z V A D可明显减
