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1、分类号华中农业大学硕士学位论文密级奶牛M I C l 表达检测及其在主要组织细胞分布研究T h eE x p r e s s i o na n dD i s t r i b u t i o no fM i c li nM a i nT i s s u e sa n dC e l l si nD a i r yC o w s研究生：祝晶学号：2 0 1 0 3 0 2 1 1 0 2 2 0指导教师：邓干臻教授指导小组：邓干臻教授 邱昌伟副教授专业：临床兽医研究方向：兽医临床诊断学获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2 0 1 3 年6 月华中农业大学动物医学学院二。一三年六月Y 2 39 4
2、6 亏本课题由国家自然科学基金资助( 资助编号：310 7 2188 ，312 7 2 6 31 )华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文砖如需保密，解密时间年月日是否保密独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了髓确的说明，并表示了谢意。研究生签名：秽函时间：秒哆年占月参日学位论文使用授权书本人完全了解华
3、中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，印学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阕览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方武在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文) 在解密后适用于本授权书学位论文储馘细函翩鲐，肋咿密签名日期：伽f 弓年5 月6 日签名a 期：1 、年厶月l - 7 国 注：请将
4、本表矗接装订在学位论文的扉页和目录之润奶牛M I C I 表达检测及其在主要组织细胞分布研究目录摘要iA b s t r a c t i i i缩略语表v1 前言11 日U 舌l1 1B o L A 研究进展11 1 1B o L A 的分子概述11 1 2B o L A I 的分子结构及功能21 1 3B o L A I I 的分子结构及功能41 1 4B o L A 的高度多态性一61 2 奶牛M I C1 的研究进展81 2 1 奶牛M I C l 的概述81 2 2M I C l 与奶牛妊娠免疫1 11 3 研究目的及意义122 材料与方法1 42 1 试验材料1 42 1 1 主要仪
5、器1 42 1 2 主要试剂152 1 3 载体及菌株152 1 4 试验动物162 1 5 试剂配制162 2 试验方法2l2 2 1 奶牛M I C l 的克隆2 12 2 2 原核表达质粒的构建2 42 2 3 重组原核表达质粒的诱导表达2 52 2 4 融合蛋白G S T M I C l 的纯化2 62 2 5 多克隆抗体的制备及纯化2 72 2 6W e s t e mb l o t 检测奶牛子宫上皮上的表达2 9华中农业大学2 0 1 3 届硕士研究生学位( 毕业) 论文2 2 7 免疫组化研究M I C l 在奶牛各主要组织中的分布313 试验结果3 33 1P C R 扩增3
6、33 1 1M I C l C D S 序列的R T P C R 扩增3 33 1 2 重组载体的酶切鉴定及测定3 43 2 奶牛M I C l 融合蛋白的原核表达3 53 3 奶牛M I C l 融合蛋白的纯化3 63 4 蛋白序列分析3 83 5 多克隆抗体的鉴定3 93 5 1 间接E L I S A 测定抗体效价3 93 5 2W e s t e r nb l o t 检测多克隆抗体特异性4 03 5 3 多克隆抗体的纯化及鉴定4 13 6 多克隆抗体M I C l 在I F N T 作用的奶牛子宫上皮细胞上的表达4 23 7S A B C 检测多克隆抗体在奶牛主要组织中的定位4 24
7、 讨 仑4 64 1 原核表达体系的选择4 64 2 奶牛M I C l 序列4 64 3M I C l 、I F N 氓奶牛子宫上皮细胞之间的关系4 74 4M I C l 在奶牛主要组织中的定位分析4 85 结论5 0参考文献51致谢6 0奶牛M I C I 表达检测及其在主要组织细胞分布研究摘要繁殖是奶牛产业中最重要的环节。奶牛繁殖不仅影响着奶牛的数量和质量，还与奶牛的生产性能及经济效益密切相关。各种原因造成的早期胚胎流失，特别是着床期胚胎流失是奶牛繁殖失败最主要原因。其中，母胎界面的“同种半导体免疫”在胚胎着床中至关重要。主要组织相容性复合体通过直接或间接免疫，影响配子品质和胚胎发育。
8、M H C I 蛋白的正常表达在动物妊娠建立、维持和分娩中具有决定性的免疫调节作用。奶牛主要组织相容性复合体IQ 链相关蛋白( M I C l ) 属于非典型M H C I ，是自然杀伤细胞( N K 细胞) 受体N K G 2 D 的配体，位于第2 3 号染色体的M H C I 区域内。M I C l 蛋白在上皮细胞、移植细胞和肿瘤细胞中表达；热应激可激发上皮细胞表达M I C l 蛋白。M I C l 蛋白的表达将激活N K 细胞，M I C l 只有与N K G 2 D 受体结合才能激活N K 细胞杀伤活性。I F N T 属于I 型干扰素家族，是反刍动物胚胎滋养层细胞分泌产生的一类糖蛋
9、白，具有维持黄体功能、建立正常妊娠、传递早期胚胎信号等功能，在胚胎着床过程中发挥重要作用。基于这些特点，我们推测I F N T 对奶牛子宫上皮细胞M I C l 的表达具有调控作用。本研究通过重组D N A 和基因表达技术，利用制备的兔抗牛M I C l 多克隆抗体，采用W e s t e r nb l o t 及免疫组织化学方法研究了M I C l 蛋白在奶牛主要组织以及奶牛子宫上皮细胞上的表达及分布情况，为今后进一步开展奶牛子宫上皮细胞上表达M I C l 功能研究及应用提供科学依据。本研究取得的主要结果如下：1 奶牛M I C l 的克隆根据G e n b a n k 的M I C l
10、的C D S 序列，设计了一对引物。以奶牛子宫组织为材料提取总R N A ；应用R T - P C R 扩增M I C lC D S 序列；琼脂糖凝胶电泳显示目的片段大小约为8 9 6 b p ；对所得到的M I C l 进行P C R 扩增，分别用B a mH I 和X h oI 进行双酶切鉴定及序列测定，与G e n B a n k 中登录号为N M0 0 1 1 2 7 3 1 7 1 的奶牛M I C l 基因同源性为9 8 ，氨基酸同源性为1 0 0 。2 奶牛M I C l 的克隆与表达利用P C R 克隆得到M I C I 片段，将目的基因分别连接到载体p G E X 4 T -
11、 1 上构建重组原核表达质粒，并成功在大肠杆菌B L 2 1 中获得了表达；表达产物通过华中农业大学2 0 1 3 届硕士研究生学位( 毕业) 论文S D S P A G E 分析，结果显示在分子量为6 3 K D 处出现蛋白条带，与目的融合蛋白G S T - M I C1 分子量大小相符。3 多克隆抗体的制备及纯化将纯化后的融合蛋白G S T - M I C l 作为免疫原，免疫家兔，成功制备了兔抗牛M I C1 高免血清，采用间接E L I S A 法检测血清抗体效价高达1 ：6 4 0 0 0 ，并采用亲和层析法对所获得的高免血清进行了纯化。4 应用W e s t e r nb l o
12、t 的方法检测奶牛子宫上皮细胞在I F N - T 作用下的差异性表达利用制备的兔抗奶牛M I C l 高免血清，采用W e s t e r nb l o t 方法检测I F N T 在不同浓度及作用时间下对奶牛子宫上皮细胞M I C l 蛋白的表达情况。结果显示，不同浓度、时间I F N T 对奶牛子宫上皮细胞M I C l 蛋白表达有所不同，且I F N T 下调M I C l蛋白在奶牛子宫上皮细胞上的表达。5 应用免疫组织化学方法检测奶牛主要组织中的表达与分布利用纯化的兔抗奶牛多克隆抗体建立了奶牛肝脏、脾脏、子宫、卵巢M I C l 蛋白表达的免疫组织化学检测方法。结果显示，M I C l 蛋白在肝脏和脾脏中表
