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3、达正常对照组小鼠粘膜层中、少数隐窝底部上皮细胞和少量的固有层单核细第3 章结果胞为P 6 5 阳性细胞，且胞核着色较浅。D S S 组的粘膜层中，残存的腺体细胞均为P 6 5 阳性细胞，粘膜层和粘膜下层有大量的炎症细胞胞核P 6 5 染色阳性。D S S + L E l 3 5 组P 6 5 表达情况和D S S 相似，D S S + A T R A 组P 6 5 表达较D S S 组相比明显下降，具有统计学意义( P 0 0 5 ，与D S S 组相比无统计学意义C D 6 8 的表达正常对照组小鼠少量的固有层单核细胞为C D 6 8 阳性细胞，胞浆着色较浅。D S S 组固有层有大量C D
4、 6 8 染色阳性细胞，较正常对照组明显增加( P 0 0 5 ) 。D S S + L E l 3 5 组C D 6 8 的表达情况比D S S 组要高( P 0 0 5 ) ，D S S + A T R A 组C D 6 8表达较D S S 组相比明显下降，具有明显的统计学意义( P 0 0 5 ) ，如表6 所示。表6 各组小鼠结肠C D 6 8 的表达情况( n = 8 )组别C D 6 8 阳性细胞数正常对照组D S S 组 R A 组L E l 3 5 组4 5 0 4 1 。2 03 2 0 0 4 3 1 62 0 6 3 士2 。7 7 *3 6 0 0 4 2 6 2 P
5、o 0 5 ，与其他各组之间的比较显著差异P 0 0 5 ，与其他各组之间的比较显著差异第4 章讨论第4 章讨论炎症性肠病的临床特点是慢性、复发性肠道炎症损伤，对于其治疗目前仍缺乏特效药物。目前其致病因素及发病机制仍不清楚，大多数研究认为与环境因素、遗传因素、感染因素及免疫因素关系密切J ，当前人类I B D 的治疗仍然依靠糖皮质激素、水杨酸制剂、免疫抑制剂等药物，但是这些药物都不能有效控制I B D 的病情，I B D 临床缓解率仅为6 0 8 0 ，并且普遍存在着药物耐受性差、副作用大、疗程长，停药后容易复发等缺点。近年来一些新型药物，如抗T N F a 抗体英夫利昔( i n f l i
6、 x i m a b ) 1 1 2 ，因有免疫源性，存在输液反应和疗效降低等缺陷，故并不能很有效的控制I B D 的病情。因此很多学者试图寻找其他的治疗方法和药物，以期更有效的治疗I B D ，探索I B D 的新的治疗方法显得日趋重要。目前已有大量的研究表明葡聚糖硫酸钠( d e x t r a ns u l f a t es o d i u m ，D S S ) 诱导的小鼠急性结肠炎模型 1 3 1 ，其临床表现和病理生理学特征与人类U C 极为相似U 4 。D S S 诱导的小鼠结肠炎的临床表现为：急性期主要的表现是腹泻、粘液血便、大便隐血阳性和体重下降；慢性期的主要表现是腹泻及血便停
7、止、体重可逐渐的恢复至发病前水平。它的病理表现为：病变是越远离肛门病变表现越轻，以直肠最为严重，近端的结肠接近于正常。急性期病变部位粘膜充血水肿，有散在的糜烂，在溃疡处也可见新鲜渗血，黏膜和黏膜下层可见大量的炎症细胞浸润。慢性期可见结肠肉芽组织增生，黏膜结构丧失，腺体变形萎缩，肠管缩短，黏膜和黏膜下层以淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞等慢性炎症细胞浸润为主。该模型的优点：1 、采用让小鼠自由饮用D S S 溶液的方法建立起模型，实验条件和操作方法简易，易复制，便于掌握和推广：2 、已证实D S S 模型是由T h l F f h 2 型细胞反应介导的【1 5 】，其发病与T N F a 、I F N
8、 吖和I L 一1 0 等有关 1 6 1 ，这与人类溃疡性结肠炎的免疫学反应很相像；3 、不同种系动物对D S S 的敏感性不同l7 1 ，为揭示遗传因素与U C 的关系提供了新的依据；4 、实验所用动物易获得，且价格比较合理，遗传学和免疫系统等各方面均与人类极为相似。该模型机制目前尚不完全清楚，可能与巨噬细胞功能障碍、肠道菌群失调、抑制上皮细胞增生、破坏肠黏膜屏障有关【1 8 J 。O k a y a s u 等f 1 9 J 观察到在D S S 作用于小鼠后第4 章讨论肠道细菌如肠杆菌属、肠拟杆菌属、肠梭菌属等均增多。H a n s 等【2 0 】人运用抗生素作用D S S 小鼠，观察到
9、D S S 小鼠结肠炎在急性期有所改善。目前大家普遍认为D S S 作用于小鼠肠道使肠道上皮细胞损伤，使抗炎成分如L P S 等向粘膜固有层移位，L P S 激活固有层免疫细胞，这些免疫细胞释放炎症因子和趋化因子，如T N F a 、I L 一1B 、I L 一1 2 、N F k B 等，诱导血液及其他部位的免疫细胞尤其是巨噬细胞向损伤肠粘膜趋化、浸润。肠黏膜巨噬细胞与其他部位的巨噬细胞一样起源于骨髓的造血干细胞，大部分在正常肠黏膜定居的巨噬细胞主要位于上皮下的黏膜固有层和集合淋巴小结 2 t l 。巨噬细胞表面有许多特异性的单克隆抗体识别标记物：C ；D 6 8 1 2 2 1 、C D
10、l 4 2 3 1 、巨噬细胞清除受体【2 4 】、巨噬细胞甘露醇受体【2 5 】、天然耐受相关巨噬细胞蛋白【2 6 】、F 4 8 0 2 丌、M C S F 受体、巨噬细胞基因1 、单核细胞特异性酯酶等。巨噬细胞在机体固有免疫、适应性免疫、炎症反应、组织修复中起关键作用，巨噬细胞可产生和分泌多种生物活性物质，如I L 1 、I L 一3 、T N F a 掣2 8 】，大量研究表明在炎症性肠病中巨噬细胞处于一种高表达状态【2 9 , 3 0 1 ，其产生的炎症因子T N F a 也明显增多，C D 6 8 作为巨噬细胞表面特异性标记物在炎症性肠病中也呈高表达状态。本实验中我们利用免疫组织化
11、学法检测小鼠结肠组织中C D 6 8 的表达情况，在正常对照组小鼠结肠组织粘膜固有层仅有少量的C D 6 8表达，D S S 结肠炎肠黏膜有大量的C D 6 8 表达，D S S + A T R A 组C D 6 8 的表达明显减少，而D S S + L E l 3 5 组C D 6 8 的表达较D S S 都有明显的增高。R A 是维生素A 的衍生物，天然R A 是由维生素A 或视黄醇衍生，视黄醇或其前体如B 胡萝卜素广泛存在于牛奶、鸡蛋及许多植物q h 3 1 1 ，在进入人体之后C H 2 0 H 被羧基取代则形成维甲酸。维甲酸由环已烯环、侧链和极性基团三部分组成。根据改造部分的不同，可
12、将维甲酸化合物分为三代。改造极性基团形成第一代维甲类化合物如全反式维甲酸( a 1 1 t r a n sr e t i n o i ca c i d ，A T R A ) ，9 顺式维甲酸( 9 c i s R A ) ，1 3 顺式维甲酸( 1 3 c i s R A ) 及维胺酸等；改造环已烯环部分形成第二代维甲类化合物如芳香类维甲酸衍生物如阿维A 酯；改造侧链部分而形成第三代维甲类化合物如丁经胺酸。在体内的生理活性代谢产物主要包括全反式维甲酸、9 一顺式维甲酸和1 3 一顺式维甲酸。维甲酸受体属于甾体维甲类甲状腺素受体超家族，按其氨基酸序列不同，可分为维甲酸受体( r e t i n
13、o i ca c i dr e c e p t o r ，P A R ) 和维甲酸X 受体( r e t i n o i dXr e c e p t o r ，R X R ) 两类，两个家系各有3 个成员( 包括a 、B 、丫) p2 | ，维甲酸信号主要通过这两个核受体家1 9第4 章讨论族介导。它们的基本结构和特异性配体均有所不同，已知R A R s 与全反式维甲酸( A T R A ) 有较高的亲和力，R X R 可以自身聚合成同二聚体，也可以和R A R 、维生素D 受体( v i t a m i nDr e c e p t o r ，V D R ) 、过氧化物酶体增生物激活受体等受体
14、结合成异二聚体，二聚体和配体结合后才能对基因转录起调节作用。当异二聚体中两受体都和配体结合时，可以协同促进靶基因结合，从而调节基因的转录和表达，发挥抗肿瘤等一系列生物学效应1 3 引。目前对维甲酸的研究相当的广泛，过去的研究发现它对恶性肿瘤【3 4 1 、肾病、肝脏疾病D 6 1 、肺气肿【3 7 1 、动脉粥样硬化3 8 1 、炎症性肠病【8 1 等疾病均有治疗的作用，但其具体的机制尚不完全明确，有研究表明它能通过抑制巨噬细胞的功能而对恶性肿瘤、慢性炎症等疾病起作用，本实验通过检测巨噬细胞的表面特异性标记物C D 6 8 观察到维甲酸也能抑制巨噬细胞向肠道浸润。肿瘤坏死因子( t u m o
15、 rn e c r o s i sf a c t o r , T N F ) 是一种由巨噬细胞产生的有广泛生物学活性的细胞因子 3 纠。肿瘤坏死因子一a 具有多重生物学效应，一方面它具有调节机体的免疫功能，除了其本身对肿瘤细胞具有细胞毒性外，它还能作用于血管内皮细胞，损伤内皮细胞或导致血管功能紊乱，使血管损伤和血栓形成，造成肿瘤组织的局部血流阻断而发生出血、缺氧坏死1 4 0 】：另一方面则介导炎症过程、组织损伤、休克等病理生理反应【4 。T N F a 是一种重要的炎症递质，在启动和维持肠组织炎症中起着非常重要的作用L 4 2 J 。T N F a 的调控与N F r , B 的关系密切，细
16、胞外刺激信号使体内N F r , B 活化，可以增强T N F a 的转录，促进后者的表达；随后T N F a 通过正反馈机制再次激活N F r , B ，不但使T N F a 的分泌进一步增加，还可诱导其他促炎细胞因子I L 一1 、I L 8 的生成和释放，引起级联反应，导致最初的炎症信号进一步放大1 4 3 l 。在I B D 中T N F a 通过与特定T N F受体结合实验其效应，从而产生潜在的细胞毒效应和促炎效应，T N F a 促炎机制包括触发中性粒细胞和单核细胞的趋化以及增加内皮细胞黏附分子的表达畔 ，刺激各种炎性介质的产生，导致组织的水肿并激活凝血系统，在I L 6 参与下，T N F a 诱导凝血酶形成，减少血栓调节素的释放，激活组织因子促进血栓形成，同时抑制机体合成纤溶酶原激活抑制剂1 而导致机体处于高凝状态，T N F a 能诱导促凝血组织因子仅在内皮损伤部位释放
