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1、流式细胞仪分析技术流式细胞仪分析技术流式细胞仪分析技术流式细胞仪分析技术?流式细胞仪(flow cytometry ， FCM) ，又称荧光激活细胞分选仪（fluorescence activated cell sorting ， FACS) ，是一种对单细胞或其他生物粒子膜表面以及内部的化学成分进行快速定量分析与分选的医学仪器。它集光学、电子学、流体动力学、细胞化学、生物学、免疫学和计算机技术于一体，可以高速度分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，对细胞大小、细胞表面抗原表达等进行定量、快速、客观、多参数的相关检测，在生物学、临床医学和药物学中已得到广泛应用。?特点1.特异性好：
2、抗原抗体反应2.灵敏度高：少量荧光即可检测到(单个细胞上小于600个荧光分子）3.多参数：十余个参数4.快速采集分析：1000-5000个细胞/秒，甚至上万个细胞5.客观性发展简史60年代至70年代-在原理和结构上形成了固定的模式80年代-在多参数检测技术上不断提高90年代-在数据管理、数据分析方面有了长足进步目前目前目前目前-转向流式细胞仪的应用，新的荧光探针、新的荧光 染料、新的染色方法流式细胞仪的分析原理?将待测标本制备成单细胞悬液，经荧光染色后由气压装置送入流动室，流动室由样品管和鞘液管组成，鞘液管充满流动的鞘液，鞘液流与样品流压力不等，当两者压力差达到一定程度时，鞘液裹挟着样品流迫使
3、细胞有序地排列成单列，逐个通过喷嘴进入激光聚焦区。Injector TipFluorescence signalsFocused laser beamSheath fluid流式细胞仪的分析原理?如果将细胞中某部分特异地标上荧光染料，那么这些染料将在通过激光检测区时受激光束激发，产生散射光和荧光信号。通过一些波长选择通透性滤光片，即可将不同波长的散射光和荧光信号区分开来。散射光和荧光信号接收后转换成数字信号送计算机处理，可在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。Injector TipFluorescence signalsFocused laser beamSheath fl
4、uid流式细胞仪的构造FCM的结构一般可分为五部分：(1)流动室及液流驱动系统；(2)激光光源及光束成形系统；(3)光学系统；(4)信号检测与存贮、显示、分析系统；(5)细胞分选系统。主要结构图流动室与液流驱动系统流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为30180um的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心。流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包。样品流在鞘液流的环包下形成流体动力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。激光光源与光束成形系统激光
5、(Laser ， light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。这是因为由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。?激光光束在到达流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为22 - 66 um即短轴稍大于细胞的直径的光斑。这种椭园形光斑激光能量分布属正态分布；为保证样品中细胞是一个一个分别受到光照并且受照强度
6、十分一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处。光学系统?FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。在FCM的光学系统中主要光学原件是滤光片( Filter ) ，主要分为三类：长通滤片（Long-Pass Filter ，LP )、短通滤片( Short-Pass Filter ，SP) 及带通滤片( Band-Pass Filter ，BP )。(1)长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如LP500滤片，将允许500 nm以上的光通过，而500 nm以下的光吸收或返回。(2)短通滤片：与长通
7、滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回 。(3)带通滤片：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光波段的范围。如BP 500 / 50表示其允许通过波长范围为475nm525nm。信号检测与分析当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号 。?散射光信号：散射光分为前向角散射( FSC ，Forward Scatter ) 和侧向角散射(SSC，Side Scatter)，散射光不依赖任何
8、细胞样品的制备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数（或称固有参数）。?前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小和面积有关，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞干扰。?侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90度方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。上述两种信号都是来自于激光原光束，其波长与激光相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找
9、出血小板和红细胞等细胞群体。荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析就能了解所研究细胞参数的存在与定量。?可选用的荧光素有多种多样，由于它们分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也各异。选择染料或单抗所标记的荧光素必须考虑仪器所配置光源的波长。BD FACSCalibur配置的激光器为488nm、633nm。BD LSRFortessa配置的激光器为405nm、488nm、633nm。荧光信号线性测量和对数测量荧光信号的线性
10、测量与对数测量主要由电子线路完成。当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(PMT) ，PMT将光信号转换成电信号。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。?线性放大器，即放大器的输出与输入是线性关系。细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。?对数放大器，即放大器的输出与输入是对数关系。细胞膜表面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大器。在免疫学样品中，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。FCM测量数据的存
11、贮、显示与分析?目前FCM数据的存贮的方式均采用列表排队(List Mode)方式。因为目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物已可多达4个，采用List Mode方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被检测4个测量参数，那么获取一万个细胞，所占容量为410000个(字或双字)。当只检测细胞一个参数时（如DNA)，可灵活的关闭其他三个参数，节省四分之三的空间。 数据文件虽然有易于加工处理分析的优点，但缺乏直观性。?数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。?1、单参数直方图：细胞每一个单参数的测量数据可整理成统计分 布，以直方图(distribution his
12、togram)来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其 单位是道数，横坐标可以是线性的，也可以是对数 的，纵坐标一般是细胞数。处在同一通道的每一细胞 均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。 通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧 光亮度越强。?双参数数据的显示?双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参数与细胞数 量间的关系, 常用的表示方法有二维点图(Dot Plot), 等高线图 (Contour Plot), 二维密度图(Density Plot)。?在二维图中, X坐标显示通道1（FL1），为该细胞一参数的相对 含量, 而Y坐标显示通道2（FL2
13、），为该细胞另一参数的含量,每个点表示一个或多个细胞。?三维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量。设门：通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。分析方法流式细胞仪的应用流式细胞仪可进行细胞内的核酸定量，倍体、细胞周期分析，细胞因子和粘附分子的检测，细胞凋亡的研究、肿瘤相关抗原的监测及细胞分选，现已广泛用于基础研究与临床检验，在免疫学、细胞遗传学、分子生物学、血液学、肿瘤学、药理学、病理学等领域发挥着重要作用。一、在免疫学中的应用?流式细胞仪运用
14、荧光抗原抗体特异性结合的原理，可同时检测出多种淋巴细胞表面抗原(CD分子)，将不同的淋巴细胞亚群区别开来，并计算出淋巴细胞各亚群的百分比，从而监控病人的免疫状态，在某些病毒性疾病的感染血液病、原发性和继发性免疫缺陷病、肿瘤的疗效观察和预后判断以及器官移植的监测上起着重要指导作用，并有助于研究各种与免疫有关疾病的发病机制。B细胞:CD3-/CD19+NK细胞: CD3-/CD(16+56)+T细胞:Th细胞: CD3+ /CD4+Ts细胞: CD3+ /CD8+?利用抗原抗体特异性反应原理，将不同单克隆抗体设法带上各种荧光染料作为荧光标记。将抗原抗体结合，形成抗原抗体-荧光素复合物，经激光照射发
15、出荧光进行检测。M1M1多色分析（3激光14色）CBA-流式液相芯片技术虽然液相蛋白定量检测的技术很多，但是大多数的技术仅能对样本进行单一指标的检测。检测多个指标时则需要提供大量的样本分批检测，操作繁琐。对于样本量较少或需要对比各指标的用户，传统的技术无法满足需要。为 此，BD公司开发了基于流式细胞仪的液相蛋白定量技术。多因子检测多因子检测多因子检测多因子检测Cytometric Bead Array（简称CBA）的基本原理近似于ELISA的检测，即利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒待测物复合体所散发的荧光，从而测定待测物的数量。二、在肿瘤学中的应用1
16、、细胞周期的检测2、细胞凋亡的检测3、转染效率的检测1、对细胞周期的检测?正常人静止体细胞有46条染色体，相当于7.10-12 pg DNA/细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化：在G1期，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体；?进入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间；当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期，G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期(G0期)，而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1，S，G2/M期。?通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M/%，了解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作
