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1、吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文摘要神经胶质瘤是中 枢神经系统最常见的恶性肿瘤， 到目 前仍没有 一种有效的根治方法。金丝桃素以往被用于抗抑郁、杭H I V病毒，近年发现其有光激活作用，光激活后能有效抑制多种肿瘤细胞生 长， 对胶质瘤细胞有比 较强的抑制作用。 金丝桃素有可能成为光动力治疗中的一种新型光敏剂， 本次动物模型试验为金丝桃素进一步临床应用提供理论依据。目 的: 研究光激活金丝桃素对胶质瘤生长的抑制作用， 并研究其对 V E G F , b F G F在胶质瘤中 表达、肿瘤微血管形成的影响，为探讨金丝桃素治疗人胶质瘤莫定基础。方法:建立W i s t a r 大鼠C 6 胶质瘤
2、同源移植模型，用不同剂量光激活金丝桃素作用于 模型， 1 6 天后切取瘤组织标本， 进行免疫组 化染色， 观察瘤组织V E G F , b F G F的蛋白 表达情况，并进行微血管计数， 运用统计分析法检测结果。结果: ( 1 ) 不同剂量光激活的 金丝桃素对大鼠C 6 胶质瘤有明 显的抑制作用，并呈现剂量依赖性，光照下，当 金丝桃素为 0 .8 ug / m l 时， 抑瘤率为6 7 .2 % ， 金丝桃素为2 .0 N 创 m l 时 抑瘤率为8 2 .4 %, 高 剂量组抑瘤作用明显高于低剂量组 ( p 0 .0 5 ) . ( 2 ) V E G F , b F G F 在大鼠C 6
3、胶质 瘤组织中均有表达，且与肿瘤 M V D呈正相关，r v F G F - 0 . 7 8 , r b F C F - 0 . 8 5 。空白 对照组中V E G F , b F G F 表达 较高， 且微血管计数吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文最多。 H Y + 光照组中V E G F , b F G F , M V D表达明显低于非光照组 及对照组( P ( 3 ) 金丝桃素吸收后的细胞分布几乎所有具有光敏化作用的物质都能发荧光。 金丝桃素分子也具有荧光。 可由荧光显微镜下观察探测它在细胞内的分布。 短期培 养时， 金丝桃素主要集中 在膜上， 长期培养后， 金丝桃素可到达细胞质和细
4、胞核， 核内 有明显吸收。另有报道， 金丝桃素主要分布在细胞核周围的细胞质中，细胞核无明显吸收。观察结果并不一致， 这可能与不同的实验条件有关， 也受显微荧光观察本身的局限性影响。荧光发射随光敏物质在细胞内不同的分布位置改变，因而不能 准确地反映光损伤发生位点， 由于细胞毒性产物单线态氧形成后移吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文动距离小于0 .0 2 u m ， 光损伤的 位置可间 接反映光敏物质受激发时的分布。许多研究者转而研究金丝桃素亚细胞水平的光损伤位点。 金丝桃素早在半个世纪前即己 在抗抑郁治疗中， 明 确其能通过血脑屏障而起作用。另有报道，1 N m o l 几 光激活的金丝桃素
5、可导致细胞总 A T P水平和线粒体呼吸功能显著而不可逆的下降， 提出线粒体可能是金丝桃素细胞光损伤的主要攻击目 标。一种假设是: 金丝桃素结合到线粒体的苯并二氮杂卓受体上; 受光激发后开启线粒体通道， 膜可渗透性增强， 释放出可引发细胞程序性死亡的细胞色 素C及其它线粒体因子。P D T目 前还是一种较新的肿瘤治疗手段， 金丝桃素也是一种研 究中的光敏物质， 因而实现以金丝桃素作为光敏物质的P D T , 临床应用还要做大量工作。( 三) 光激活的金丝桃素治疗肿瘤试验研究金丝桃素可对多种肿瘤细胞产生细 胞毒作用， 已 有实 验表明 金丝桃素对体外培养的和动物移植模型上皮细胞癌、 乳腺癌及皮肤
6、癌 有明确的抑制作用p e T h o m a s 等 1 s 】研究认为， 金丝桃素对线粒体中线粒体琉拍酸氧化酶的抑制是金丝桃素抗肿瘤活性的标志。 金丝桃素可直接引 起癌细胞程序性死亡， 并伴随有细胞色 素C由线粒体 向细胞质释放。另有报道，1 u m o l 光激活的金丝桃素可导致细 胞 总 A T P水平和线粒体呼吸功能显著而不可逆的下降， 提出线粒体 可能是金丝桃素细 胞损伤的主要攻击目 标【 19 由于胶质瘤细胞能量的需要是葡萄糖依赖性的， 它的代谢取决 于己 糖 磷酸 激 酶( H e x o k in a s e ) , 2 0 . 2 1 , 2 2 . 2 3 . 2 4 这
7、 种酶 主 要附 着 在线 粒体上，细胞内P H值的降低可导致附着在线粒体上的己 糖磷酸激吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文酶的 释放， 结果 造成葡萄 糖磷酸 化减少， A T P 含量减少和细 胞增生 减少，因 此细胞内P H可能是胶质瘤治疗的靶点。 金丝桃素是一种光敏的可展示多种生物学活性的物质， 它的可能活性是通过1 1 型需 氧光敏机制产生单线态氧。金丝桃素也能通过光诱导细胞内P H值下降导致金丝桃素活性机制的产生。蛋白 激酶C ( P K C ) 系统是神经胶质瘤信号转导途径之一2 5 1 体外实 验显示2 6 . 2 7 1 ， 许多 报导在体外实 验中 2 8 . 2 9
8、. 3 0 1 ，恶性胶质瘤 对P K C调节十分敏感。 P K C活性与这些肿瘤细 胞的增殖有密切关系。 P K C不仅与调节肿瘤细胞的增殖有关， 而且对神经胶质瘤的发生也起着非常重要的作用。金丝桃素是较强的 P K C抑制剂。金丝桃素对 P K C的抑制是不可逆的。因此，在临床中用较小的剂量即 能 抑制P K C 。 实 验 证实 : 光激活的 金丝 桃素 在2 u g / m l 微小 剂量即 可抑制C 6 胶质瘤体外培养细胞生长并诱导其凋亡;对 C 6细胞同 源移植的肿瘤同 样具有较强的抑制肿瘤生长能力。 通过肿瘤组织的 免疫组化及W e s t e rn印 迹杂交， 可以看到在光激活
9、的金丝桃素作用 下，其P K C呈弱表达， 5 . 1 1 ，而阳性对照组P K C表达率较高，2 4 .7 8 %， 提示金丝桃素抑制肿瘤生长是通过抑制P K C这条通路发挥作用的。增殖细胞核抗原 ( P C N A ) 足一种 3 6 k D的非组蛋白细胞核多肤，是 D N A复制的必需物质，其含量与细胞增殖状态密切相关，现已 成为检测肿瘤细胞增殖动力学的可靠指标。 P C N A合成并定位于细胞核中，与细胞增殖的周期有关。从 G , 晚期开始增加，S期 达到高 峰， 是G , 期的2 一 3 倍， G 2 期和M期则 持续下降， G 。 期维 持在最低水平3 1 。其合成和表达与肿瘤细
10、胞群体增殖状态密切相吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文关。 在对胃 癌、 膀脱癌和前列腺癌等进行的P C N A检测， 发现肿瘤 细 胞P C N A有过 度表达， 不同 级别的 胶质瘤均 有P C N A表达 3 2 体外实 验发现， F C M显示其抑制细胞增殖的周期主要在G o - G , 期， 金丝桃素作用于C 6 胶质瘤后， 肿瘤组织的P C N A不同表达与药量 及光照有关，肿瘤组织免疫组化显示:光激活金丝桃素作用组P C N A表达弱为1 1 .3 6 % ，而 对照组表达强且有显著性差异。不同的光能量密度、药量及照射与 C 6细胞共同培养4 8 h ，用 M T T的方法
11、检查细 胞存活率， 发现: 光照1 0 H Y从2 .O u g / m l 起， 对 C 6细胞生长具有明显的抑制作用，抑制率达到 4 5 . 0 1 % 。随着H Y浓度的增高，对 C 6的抑制作用也增强，呈现剂量依赖性，但增长幅度近于平台表现，最大抑制率为 6 4 .2 %。光照 2 H Y在 l O .O u g / m l 时， 其抑制率为3 2 .4 % ，而 非 光条 件下的H Y 对C 6 细 胞 抑制率仅为1 7 . 8 %。 说明光对肿瘤细胞的杀伤作用随用药与照射时间的延长而增强，随光能量密度的增加而增强。Z h a n g 1 15 浮还 观察到 金丝 桃素能 协同 地增
12、强 对人恶 性 神经 胶 质 瘤的辅射作用。培养的瘤细胞在以射线照射之前用金丝桃素 ( 0 . 5 u g / m l ) 处理， 较单独照射时 对肿瘤细 胞的杀伤力增强。 这是否由 于对 P K C的 抑制所致，尚 待研究。另一种解释是由于 金丝桃素抑 制了 单氧和自由基( 它们耗尽了细胞内 新生自 由基扑灭者， 如谷脱甘肤) ，从而使瘤细胞对粒子辐射的作用更敏感了。二、V E G F , b F G F与肿瘤血管生成( 一) 肿瘤血管生成血管生成( a n g i o g e n e s i s ) 是指毛细 血管 从已 存在的 血管周围 生 成的过程，包 括内 皮细胞激活、 细胞外基质和
13、基底膜降解、内 皮细吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文胞迁移和增殖、 管腔结构形成、 融合以 及细 胞外基质重建等多个步 骤。 研究表明， 血管生成对肿瘤生长和转移起到关健的作用。 肿瘤 小于2 m m ， 时，无血管生长， 通过弥 散作用汲取营养，此即血管前 期。进入血管期， 肿瘤诱导血管调节因子正平衡， 诱导内皮细胞增 殖， 毛细血管出芽。 新生血管由周围的宿主血管长入， 肿瘤血管化，迅速生长。 肿瘤细胞侵入新生血管并形成肿瘤栓子。 肿瘤细胞远处 种植、转移，重复血管生成过程。在成熟的健康组织，内 皮细胞处于静止状态。 在伤口 愈合、 组 织修复、 妇女生育和月经期、 胎儿发育等生理刺
14、激下出 现新生血管 生成属于生理性血管生成。 此时在血管生成刺激因子和抑制因子的 严格控制和协调下， 血管生成成为一个发生在有限时间内 的有序生 理进程，增生的内 皮细胞很快恢复到正常的静止状态3 3 . 3 4 . 3 5 肿瘤细胞通过改变血管生成调节因子的局部平衡， 上调血管生成刺激因子或下调血管生成抑制因子，使内皮细胞增殖和血管生 成， 这种 “ 血管生 成开关( a n g i o g e n e s i s s w i t c h ) ， 可能 是肿瘤生长 所必需的 3 6 。 血管的 形成大大改 善了 肿瘤的供应并带 走其代谢废物。早在1 9 4 7 年， A l g u i r
15、e G H就注意到生长期肿瘤能够 诱发宿主 新生毛细血管生长。T a n n o c k( 1 9 7 0 ) 证实肿瘤细胞的分裂速度与创门 和供血血管的 距离 成反比， 他进一步提出， 肿瘤的生长速度是 由 血管内 皮细胞间 接决定的， 肿瘤细 胞和内 皮细胞之间具有双向促进的关系。F o lk m a n J 也指出，除非能够形成新生血管，否则肿瘤体积一般不 会超过镜下大小， 血管生长期肿瘤则 超过2 - 3 m m 3 5 3 ) , 生长速率增加了2 0 倍， 新生血管生成受阻， 甚至可导致肿瘤消退。吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文血管生成也是肿瘤浸润和转移的主要原因， 高 血管
16、密 度肿瘤比低血 管密度肿瘤更容易 发生浸润和转移。 肿瘤部位形成高密度不成熟的新生血管增加了肿瘤进入血液循环的机会，这些血管基底膜不完 整， 缺少 细 胞间 连 接复 合物，易 于 肿 瘤细 胞穿 过 3 7 1血管生成在肿瘤发展中的作用: 肿瘤很小( 半径 1 1 例为基底细胞癌 ( B C C) 进行了治疗。这些病人 均采用病灶坏损区内注射金丝桃素， 然后在可见光下照射, S C C给吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文药 剂量为4 0 - 1 0 0 u g / 次， 3 - 5 次 / 周， 持续2 - 4 周; B C C 为4 01 0 0 u g / 次， 3 - 5 次 / 周， 持续2 - 6 周。 结果 表明， 金丝 桃素具有选 择性 肿瘤目 标靶作用， 病损区 周围的 组织没有坏死或细胞缺失， 同时抑 制了 恶性肿瘤的增殖， 大部分病人痊愈。 其疗效依赖金丝桃素的浓度和总药量。 本实验正是借鉴此文献报导， 通过动物与人体的每公 斤体重等效折算:已 知 A种动物每公斤体重用药量， 欲估计B种
