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1、.崛 殆护原 创 性 声 明本人声明: 所呈交的硕士学位论文， 是本人在指导教师的指录 下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的勺 容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的乍 品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均己在文户 以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承旦。学位论文作者签名:) 1 琴日 期 : 3 6月少日关于论文使用授权的说明本人同意学校有权保留并向国家有关部门送交学位论文的复印件，允许论文被查阅和借阅。同意 ( 或不同意) 学校及国家有关机构有权公布论文的全部或部分内容，并采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。论文作
2、者签名日 期 :J -“ 3:) 4 1 106 。 犷指 导 教 师 签 名 : 除光、 、 ， 书 日 期: . o 0 = , . ， “ 、 / 、吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文+ 曰 1 不 E要梗阻性黄疽 ( 简称梗黄) 是肝胆外科的常见病，易并发肾功能损害， 其原因 是多方面的。 近年研究表明，内皮素 ( E T) 和一氧化氮 ( N O) 可能在梗黄肾领害中 起着重要作用，但其机理尚不完全清楚，为此我们设计本实验， 建立梗黄大鼠 模型，于术后1 4 天、 2 1 天分别测定手术组对照组、 梗黄组、 L - A r g 组及L - N A M E组大鼠 血浆E T - 1
3、 和N O含量，并观察各组大鼠肾功能的变化及肾 组织形态学改变. 发现梗黄早期， 机体代偿良 好， N O与E T - 1 的协调关系能维持正常， 肾功脆损害较轻; 而随着梗黄时间的延长， 肾 功能损害程度超过了 机体的代偿能力， N O与E T - 1 的协调关系 被破坏， 肾 功能损害加重， 表明N O与E T 正常的协调关系，对保护和维持肾 脏功能起着重要作用。诱导N O产生，阻断E T作用，有可能成为梗黄围手术期治疗的新途径。关健词:一氧化氮 内 皮素 梗阻 性黄疽 肾 损害 L - 精氨酸吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文前言梗阻性黄疽( 梗黄) 是肝胆外科的常见病， 术后易 并
4、发肾 衰， 死亡率高达7 0 - 8 0 % “ ， 其发病 机理尚未完 全明了， 可能与下列因素有关: 低血压、 低血容量、肾脏血管收缩、肾细胞能量代谢障碍、内 毒素血症、高 胆红素血症、肾 血管纤维素沉积、 全身 血流动力学改变、肾 血流动力学改变、 低血管反应性等2 1 。 但梗黄 引 起肾 损害已 成共识。 如何减轻肾 损害， 从而降低梗黄术后肾功能不全的发生率和死亡率， 是梗黄围 手术期值得深入研究的课题。既往研究认为梗黄引 起肾 损害主要与内 毒素血症有关。 胆道梗阻时， 胆盐的肠肝循环中断， 肠腔内细菌过度增殖，内毒素产生增多，而肠粘膜屏障受损，肠道通透性增加3 -4 ，内 毒素
5、从肠道吸引 增多; 加上胆道梗阻时肝脏k u f f e r 细胞功能受抑， 机体免 疚功能下降， 对内 毒素清除 减少 5 1 ， 从而 造成内 毒素 血症。内 毒素的本身 毒性及其激活炎 症介质和细 胞因 子的过 度释放， 使肾 血管收缩，肾 小球、肾 血管内、爵f 、 管周围纤维素沉积， 导致肾功 能 紊乱6 1 。故临 床上针对内 毒素血症， 治疗多采用术前口 服脱氧胆酸钠或乳果糖以减少肠源性内 毒素的吸收， 从而降低血循环中内 毒素的含量; 或静脉滴注6 5 4 - 2 及应用杭类脂A单克隆抗体直接中 和循环血中 的内 毒素等， 这些均取得良 好疗效。近年随着对肾内 血管活性物质研究
6、的深入， 发现肾 脏自 身可以合成多种血管活性物质并分布有相应受体，以自 分泌/ 旁分泌吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文方式对肾 血流及肾功能进行重 要调控， 其代谢失衡在肾 脏的病理生理过程中发挥重要作用。其中N O和E T是最为关键的一对血管内 皮细 胞生成， 释放的 血管活性物 质7 1 ( 内 皮细 胞是 位于 血管腔内面的单层上皮细胞， 介于血液和平滑肌之间， 不仅起一种机械的屏障作用， 还参与多种调节机制， 如决定血管壁张力， 控制 平滑肌细胞增殖， 参与调节局部止血及对炎症和免疫反应的活性作用等 ) 。E T 是1 9 8 8 年由日 本Y a n a g i s a w
7、a 等从猪的 主 动脉内 皮细 胞分 离纯化出来的一种由2 1 个氛基酸组成的血管活性多肤， 是目 前所知作用最强的长效血管收缩剂8 1 . E T包 括三个亚型( 内 皮素一 1 ,内 皮素一 2 ， 内 皮素一 3 ) ， 但内 皮组织只通过旁分泌作用产生一种内皮 素 一 1 。内 皮 素 在 循环 血中 的 含量 很低， 提示 生 理 情况 下 在N O 等抑制作用下分泌很少或多向非管侧的平滑肌细胞释放.刺激E T分泌的因 素有缺氧、剪切力、 凝血酶、 血管紧张素1 1 、内 毒素血症和高 胆红素血症等. E T血浆半衰期为4 - 7 m i n ， 但因其通过受体结合发挥作用， 且与受
8、体结合紧密， 解离 较慢， 使作用得以延长。目 前已 发现2 种类型的内 皮素受体A和B A型主要表达在平滑肌细 胞、心 肌细 胞和脑血管细 胞，而B型则主要表达在内 皮细 胞. B型受 体又可以分为B . 和B 2 亚型。 B ， 受 体主 要表达在内 皮细胞， 与血管舒张剂的释放相偶联; B : 受体主要表达在血管平滑肌细胞，与血管收缩剂相偶联。 E T受体在各种组织中的不同 分布，决定了 在一定的器官的主要血流动力学 作用，并取决于所兴奋的受体类型及其部位的数量， 不同的传导途径产生吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文不同的作用. 低剂量时激活位于内 皮细胞上的E T - B : 受体
9、， 同时偶联N O . P G I Z ( 前列环素) 、 E D H F( 内 皮源性超极化因子) 的释放而引 起血管舒张.高剂量时和平滑肌细 胞上的E T - B , 或E T -A受体结合引 起显著且持续的血管收缩， 是一种强有力的 血管收缩剂。内 皮素的作用机制:E T和受体结合后，主要通过激活与G蛋白 相偶联的 磷脂酶C ( P L C ) ， 生成D G 和I P ; ， 继之生成l p q , I P 3 促进细 胞内 肌浆网 释放C a 2 + ， 而I P ; 则 开 放细 胞 膜钙 通 道 使 钙 内 流， 最终 使细 胞内C 扩 + 浓 度大 幅 度升高 。 C 扩 +
10、与 钙调素结 合后，激活肌球蛋白轻链激酶等，引 起钙介导的平滑肌收缩。同时还可通过 D G活化蛋白激酶 C ( P K C ) ，改变离子通道的通透性，激活电压依赖性钙通道， 激活磷脂酶A ( P L A ) , 促进N a 十 旧十 交换，关闭A T P 敏感性 钾通道等， 最 终 加强C 扩 + 介导的细 胞收缩过 程19 11 9 8 7 年前 后P a l m e r 和I g n a r r o 通过 各自 实 验证实， N O即内 皮源 性 舒张因 子， 是由 左 旋 精 氛酸( L - A r g ) 经N O 合酶( N O S )代谢产生的， 在众多生理和病 理过程中 发挥重
11、 要作用. 化学刺激( 如受体门 控性的激动剂) 、物理刺激 ( 如剪切力) 或内 皮细胞及血管壁本身释放的介质 ( 如内 皮素、 缓激肤) 等p o t作用于内 皮细胞膜与受体结合，通过激活抑制性鸟普酸结合调节蛋白 ( G i蛋白) 介导的 磷脂酶C ， 产生D G和I P 3 ， 继之磷酸化为I P 4 , D G激活蛋白激酶C , I P 3 促使细胞内 钙释放， I P ; 则使细胞外钙内流I l l . C a 2 + 与钙调素结合则可激活N O S ， 催化底物L - A r g 产生N O ,调节血管舒张张力从而调节血流及血压; 内皮细胞和血小板产生吉 林 大 学 硕 士 学 位
12、 论 文的N O同时具有抑制血小板聚集和粘附、 抑制白细胞粘附、 抑制 血管收缩肤内 皮素的分泌及调节平滑肌细 胞增殖 作用1 2 1 ， 防止血管痉孪及血栓形成， 从而维持重要脏器如心脏的 血液灌流。 此外，N O在宿主防御和免疫反应中亦可由平滑肌细胞、内皮细胞、单 核细 胞通过可 诱生 型N O S 大 量产生 1 3 1 ， 此种N O的 产生首见于 活化的巨 噬细胞。N O的细胞毒性细胞生长抑制作用是对呼吸链中的关 键酶及靶细胞D N A合成的抑制作用【 1 4 1 a N O也可与氧原性自由 基反应产生其它毒性物质， 如: 峭基过氧化物( O N O O - ) 15 1 N O 的
13、 作 用 机 制 : N O 激 活G C 而 使。 G M P 升 高 ， c G M P 的升高主要作用于c G K s ( c G M P 依赖性蛋白激酶) ， 使许多 钙依赖性的细胞内 传导信号蛋白 磷酸化而减少钙内 流， 从而 抑制钙介导的肌球蛋白 轻链磷酸化而 使血管舒张。 6 1 ,还可通过增加钙 A T P酶对钙摄取或直接作用于收缩蛋白而使血管舒张。 在某些 血管组织中， c G M P 还可特异性抑制磷酸二醋酶活性， 阻止c A M P 降解，加强。 A MP 介导的舒张作用。此外， N O亦可通过直接作用于钾通道， 如大电 导的 钙激活的钾通道 B K C a ) 而 发挥
14、作用 1 7 1 。由 于N O在体外实 验中的半衰期极短 ( 大约6 s ) ,所以直接检测很困 难， 目 前多通过对其代谢产物亚稍酸盐含量的测定或对继发效应的分析间 接评价， 应用最多的有N O S 抑制剂如左旋稍基精氛酸甲醋 ( L - N A ME ) e综上所述，E T诱生N O , N O又可抑制E T合成，二者之间的这种平衡关系 在生理条件下使血管张力 保持正常， 提供器官血流， 维持和保护器官功能。 一旦平衡破坏即会影响器官功能， 加吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文重病情变化.因 此近年人们对于E T 和N O在梗黄肾 损害中的作用越来越关注， 但对于二者在梗黄肾 损害中
15、的作用机理尚无系 统深入的研究.K r a m e r等观察发现梗黄大鼠血浆 E T 1水平和尿E T 1 排泄均明显升高，进一步测定各部位肾 组织E T 1 含量证实肾内E T 1 生成增加的部位主要在髓质和乳头，受体拮抗剂氨基孤可明显改变梗黄大鼠G F R和尿液浓缩功能 8 1S a r a 。等亦通过动物实验证实给予胆总管结扎鼠氛基孤可明 显阻 止E T 升高 1 9 1 ， 提示 梗黄可诱导肾内E T的 表达和分泌， 在梗黄肾 损害中 可能 有重要作用。 相反， 国内刘祥德等2 0 1报道梗黄大鼠 血浆E T 1 合成减少， N O明显升高; 进一步 研究2 1 证明N O 对梗黄肾
16、损害 有一定的作用， 给予N O S抑制剂对梗黄大鼠肾脏 有保护作用， 而 这与刘国 平等2 2 4 勺 研究 报道 相矛 盾。 为 此我 们设计本实验， 建立梗黄大鼠模型， 采用特异性放射免疫分析方法和稍酸酶还原法于术后1 4 天、 2 1 天分别测定手术组对照组、 梗黄组、 L - A r g 组及L - N A M E 组大鼠 血浆E T 1 和N O含量， 并观察 各组大鼠肾功能的变化及肾 组织形态学改变， 旨 在阐明E T 和N O在梗黄肾 损害中的变化及作用机理， 为临 床梗黄病人围 手术期的治疗提供实验依据。吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文材料与方法一、实验动物分组及处理实 验动物采用健康W i s t a r 大鼠4 8 只 ( 由吉林大学白求恩医学 部实 验动物中 心 提供) ， 体重2 0 0 - 2 3 0 g , 雌雄不 构，随 机分为4组。1 、 手术组对照 组( 1 组， n = 1 4 ) : 1 0 % 水 合氛醛( 0 .3 m l / l 0 0
