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1、郑州大学硕士学位论文PGE对缺氧复氧乳鼠心肌细胞凋亡的影响姓名：马香芹申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：付润芳;翁世艾20030501郑州大学2 0 0 3 届硕士研究生论文P G EJ 对缺氧复氧乳鼠心肌细胞凋亡的影响P G E 。对缺氧复氧乳鼠心肌细胞凋亡的影响研究生马香芹 导师付润芳翁世艾 郑州大掌医掌院药理教研室4 5 0 0 5 2摘要凋亡和坏死是急性缺血再灌注过程中心肌细胞死亡的两种不同形式。凋亡不同于坏死，它是一种能动性的生理性细胞死亡过程，具有特征形态和生化改变，这些改变是一系列基因活动引起的级联反应的结果。因此，深入研究急性心肌缺血再灌注过程中的细胞凋亡现象对心肌缺血再
2、灌注损伤的防治具有重要的意义。前列腺素E ( P r o s t a g l a n d i nE l ，P G E l ) 是前列腺素的一种，具有抑制血小板聚集、扩张血管、改善微循环，保护缺血性心肌，缩小心肌梗死面积的作用。是目前用于治疗心绞痛、心肌梗死、血栓栓塞性疾病的药物之一。以往的研究证实P G E I 对冠状动脉结扎法所致的心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，但P G E l 能否抑制心肌细胞的凋亡，目前尚未见报道。本课题采用离体纯化培养的乳鼠心肌细胞建立缺氧复氧损伤模型，观察在该损伤过程中心肌细胞的凋亡现象及P G E - 对缺氧复氧乳鼠心肌细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法
3、实验采用新生1 3 d 的W i s t a r 大鼠乳鼠，无菌条件下开胸取出心脏，P B S 缓冲液冲洗后用0 1 2 5 胰蛋白酶反复消化，收集心肌细胞悬液，差速贴壁法纯化后制成浓度为5 x 1 0 5 m 1 4 的细胞悬液，接种到2 5 m l 培养瓶中培养，实验采用培养7 2h后的原代心肌细胞。用缺氧溶液置换正常培养液密闭培养3 0 m i n 造成缺氧，用复氧溶液置换缺氧溶液培养4 0 m i n 后造成再复氧损伤。实验分五组：正常细胞培养组，缺氧复氧损伤( H R ) 模型组，缺氧复氧损伤+ P G E I 小剂量( 5 p g - L 。1 ) 组，缺氧复氧损伤+ P G E
4、l 中剂量( 1 5 a g L 。1 ) 组，缺氧复氧损伤+ P G E l 大剂量( 4 5 9 9 L d )组。分别从形态学、生化学、分子生物学等方面观察缺氧复氧损伤乳鼠心肌细胞的凋亡现象及P G E l 对凋亡的影响。郑州大学2 0 0 3 届硕士研究生论文P G EJ 对缺氧复氧乳鼠心肌细胞捅亡的影响结果1 心肌细胞形态学改变倒置显微镜下观察，正常心肌细胞培养3 天后，细胞成簇生长，伸出伪足，折光性强，且搏动明显。细胞形态呈现多样化，如圆形、梭形及椎形。缺氧复氧损伤后心肌细胞伪足缩短或消失，折光性下降，搏动减弱或消失。P O E I 各给药组心肌细胞形态得到明显改善。2 心肌细胞电
5、镜超微结构心肌细胞电镜超微结构显示，正常细胞培养组细胞基本结构完整、清晰，核染色质均匀分布，未见核固缩现象。缺氧复氧损伤组的多数细胞胞浆减少，核深染，固缩，染色质不均匀有边集现象，部分染色质呈典型半月体样改变。P G E l 各给药组多数细胞结构接近正常，少数有染色质轻度边集，核深染等形态学变化。3 D N A 琼脂糖凝胶电泳检测心肌细胞D N A 梯状条带正常心肌细胞培养组D N A 电泳呈一条大分子D N A 片段，为正常基因组D N A 带形，紧靠加样孔。缺氧复氧损伤组D N A 呈明显的非随机降解状态，在4 0 0 b p 、6 0 0 b p 、8 0 0 b p 、1 0 0 0
6、b p 左右出现了3 - 4 条区带，在电泳中呈特征分布，即凋亡独有的“梯状图谱”。P G E l 各给药组随剂量的增加，电泳中D N A 的梯状条带逐渐减弱。P G E l ( 4 5 l a g L 。1 ) 组接近正常基因组D N A 带形。4 T U N E L 法检测心肌细胞凋亡率正常心肌细胞培养组偶见阳性核染色标记。缺氧复氧损伤组心肌细胞有较多的阳性标记，细胞核呈紫蓝色颗粒，有的聚集成团，有的染色质边缘化。P G E l ( 4 5 l a g L 。1 ) 组只有散在的阳性标记，其凋亡率( 6 8 01 9 9 ) 与缺氧复氧损伤组( 1 1 4 0 + 2 3 2 ) 相比差异
7、有统计学意义( P 茸莩_巷IIb鲎尝987654321O暑磐莹葛丑ko詈嗣茸兽_岛II盖3眉。暑郑州大学2 0 0 3 届硕士研究生论文P G EJ 对缺氧复氧乳鼠心肌细胞凋亡的影响F i g lL i g h tm i c r o g r a p h so f c a r d i o m y o c y t e si nc o n t r o lg r o u p ( 4 0 0 )F i 蛇L i g h tm i c r o g r a p h so f c a r d i o m y o c y t e si nI - I Rg r o u p ( 4 0 0 )前州大学2 0 0
8、3 届硕士研究生论文P G EJ 对缺氧复氧乳鼠心肌细胞凋亡的影响F i 9 3L i g h tm i c r o g r a p h so fc a r d i o m y o c y t e si nH R + P G E I ( 5 嵋L 1 ) g r o u p ( x 4 0 0 )F i 9 4L i g h tm i c r o g r a p h so f c a r d i o m y o c y t e si nH 瓜+ P G E l ( 1 5 9 9 L 。) g r o u p ( x 4 0 0 )辫援大学2 0 0 3 届蠖士研究生诧文P G E t 对蚨轭
9、复氧瑰疑心飘缨魁孺亡舱影响F i 9 5L i g h tm i c r o g r a p h so f c a r d i o m y o c y t e si nH 瓜+ P G E l ( 4 5 9 9 L 1 ) g r o u p ( x 4 0 0 )F i 9 6E l e c t r o nm i c r o g r a p h so f c a r d i o m y o c y t e sF i 妒E l e c t r o nm i c r o g r a p h so f c a r d i o m y o e y t e si nc o n t r o lg r
10、o u p ( x 4 0 0 0 )2 1i nH Rg r o u p ( x 8 0 0 0 )妻蛰茎兰! 塑! 堡篓圭篁茎篓篓茎塑黧! 茎壁萋差蔓鍪骜堂鳖鳖鍪窭圭鳖鬟塑F i 9 8E l e c t r o nm i c r o g r a p h so f c a r d i o m y o c y t e sF i 9 9E l e c 仃o nm i c r o g r a p h so f c a r d i o m y o c y t e si n I f R + P G E I ( 1 5 t g L 【) g r o u p ( 5 0 0 0 )i n H R + P
11、 G E l ( 4 5 9 9 - L _ I ) g r o u p ( x 4 0 0 D )F i g l1T U N E Ls t a i n i n go f c a r d i o m y o c y t e si nc o n t r o lg r o u p ( l o o o )郑州大学2 0 0 3 届硕士研究生论文P G EJ 对映氧复氧巍鼠心肌细胞凋亡的影响F i 9 1 2T U N E Ls t a i n i n go f c a r d i o m y o c y t e si nH Rg r o u p ( x 1 0 0 0 )F i 9 1 3T U N
12、 E Ls t a i n i n go f c a r d i o m y o c y t e si nH 瓜+ P G E I ( 4 5 9 9 L 。1 ) g r o u pf l o o o )帮州大学2 0 0 3 届硕士研究生论文P G EJ 对缺氧复氧乳鼠心肌细胞凋亡的影响F i 9 16D e t e c t i o no fb c l 一2m R N Ab yi ns i r eh y b r i d i z a t i o ni nc a r d i o m y o c y t e si nc o n t r o lg r o u p ( 1 0 0 0 )F i 9
13、17D e t e c t i o no fb c l 一2m R N Ab yi ns i t uh y b r i d i z a t i o ni nc a r d i o m y o c y t e si nH Rg r o u p ( x10 0 0 )2 4郑州大学2 0 0 3 届硕士研究生论文P G E t 对缺氧复氧乳鼠心肌细胞捅亡的影响F i g l8D e t e c t i o no fb c l 一2m R N Ab yi ns i t uh y b r i d i z a t i o ni nc a r d i o m y o c y t e si nH 很+ P
14、G E l15 p g L 。1 9 r o u p ( xl0 0 0 )F i g l9D e t e c t i o no f b a xm R N Ab yi ns i t uh y b r i d i z a t i o ni nc a r d i o m y o c y t e si nH R + P G E l 4 5 I t g - L 1 9 r o u p ( l o o o )郑州大学2 0 0 3 届硕士研究生论文P G E - 对缺氧复氧乳鼠心肌细胞掏亡的影响讨论急性心肌梗死早期再灌注治疗能挽救频危心肌，但同时会引起再灌注损伤，过去曾认为再灌注仅使不可逆损伤后的心肌细
15、胞加速死亡崩解，而不会加重或引起新的心肌损害，但近年有证据表明再灌注损伤也有凋亡发生。1 9 9 4 年G o t t l i e b 首次在兔心脏上验证了再灌注损伤致心肌细胞凋亡的现象，H e n r y 等1 1 1 于19 9 6 年证实大鼠心肌缺血、再灌注均可出现心肌细胞凋亡，再灌注加速凋亡的发生，K a j s t u r a 等【l 列研究证实大鼠持续心肌缺血会出现早期凋亡，国内曾有学者研究发现，缺氧可诱导体外培养的心肌细胞发生凋亡【1 3 】。凋亡不同于坏死，坏死是以线粒体以及其他细胞器肿大、细胞膨胀导致细胞膜破裂等形态变化为特征，染色体D N A 被切成不均等的片段，它是一种被
16、动性的不受基因调控的病理性崩溃过程；而凋亡是以细胞核浓缩，染色体D N A 被以核小体为单位切成梯状片段( 1 a d d e r ) ，细胞缩小，最终形成细胞凋亡小体等形态变化为特征，它是一种能动性的受基因调控的生理性细胞死亡过程。对心肌缺血一再灌注损伤病变中一t 3 肌细胞凋亡的研究，对临床治疗和预防再灌注损伤，寻求保护心肌的有效措施具有重要的意义。本实验采用原代培养的心肌细胞，模拟在体的缺血再灌注建立的缺氧复氧损伤模型中，从形态学上也观察到很明显的心肌细胞凋亡特征，表现为细胞表面伪足消失、边界不清、细胞搏动减弱，电镜超微结构表现出染色质边缘化、核固缩等凋亡早期特征。P G E l 是前列腺素的一种，具有抑制血小板聚集，改善微循环，保护缺血性心肌，缩小心肌梗死面积的作用。本实验中P G E ，各给药组心肌细胞的形态结构均明显改善，多数细胞结构接近正常，仅少数有染色质轻度边集，核深染等形态学变化。凋亡细胞的D N A 分解的特点是双链D N A 的断裂点在核小体之
