《CD28和TCR跨膜信号转导的机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CD28和TCR跨膜信号转导的机制研究（120页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、作者姓名：指导教师：学位类别：学科专业：培养单位：密级：博士学位论文C D 2 8 和T C R 跨膜信号转导的机制研究2 0 1 3 年5 月学一大院咖学姒科国螂中固I I I I II II I I II II I I II IIII Y 2 4 3 10 3 7M e c h a n i s t i cs t u d yo ft h ec r o s s m e m b r a n es i g n a lt r a n s d u c t i o no fC D 2 8a n dT - c e l lr e c e p t o rW e iY a n gAT h e s i sS u
2、b m i t t e dt oT h eU n i v e r s i t yo fC h i n e s eA c a d e m yo fS c i e n c e sI np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n tF o rt h ed e g r e eo fD o c t o ro fN a t u r eS c i e n c eI n s t i t u t eo fB i o c h e m i s t r ya n dC e l lB i o l o g yS h a n g h a iI
3、n s t i t u t e sf o rB i o l o g i c a lS c i e n c e sC h i n e s eA c a d e m yo fS c i e n c e sM a y , 2 0 1 3谨以此博士学位论文献给我的父母，感谢他们对我的辛勤养育。C D 2 8 和T C R 的跨膜信号转导的机制研究目录摘要1中文摘要1英文摘要31 弓I 言，62 材料与方法2 12 1 实验材料2 12 1 1 常用缓冲液配方2 12 1 2 基本化学试剂2 22 1 3 试剂盒，酶类及抑制剂2 52 1 , 4 细胞系2 62 1 5 抗体2 62 1 6 仪器2 8
4、2 2 实验方法3 02 2 1 脂质双分子层L U V ( L a r g eU n i l a m e l l a rV e s i c l e ) 的制备3 02 2 2 脂质双分子层B i c e l l e 的制备3 12 2 3C D 3 C D 2 8 胞内段蛋白表达与纯化3 12 2 4C D 3 C D 2 8 胞内段肽段的荧光标记3 42 2 5 平衡微透析方法检测蛋白与酸性磷脂的结合一3 42 2 6 圆二色谱检测蛋白结合酸性磷脂脂质双分子层后的构象变化3 52 2 7 酪氨酸荧光光谱检测酪氨酸在脂质双分子层中的包埋3 62 2 8 荧光芡振能量转移( F R E T )
5、 检测C D 2 8 与细胞质膜内层的结合3 72 2 9 体外磷酸化实验( I nV i t r oP h o s p h o r y l a t i o n ，I V P ) 3 82 2 1 0 抗体交联激活J u r k a tT 细胞，检测C a 2 + 内流3 92 2 11 小鼠脾脏C D 4 + T 细胞的分离3 92 2 1 2 抗体交联刺激小鼠原代C D 4 + T 细胞，胞内染色及流式检测1 L 2 的表中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士毕业论文C D 2 8 和T C R 的跨膜信号转导的机制研究达4 02 2 13J u r k a tT 细胞免疫荧光染色4 1
6、2 2 14S p i n n i n g D i s kC o n f o c a l 或T I R F M 捡测T 细胞C a ! + 内流以及C a ! +m i c r o d o m a i n z I ：12 2 1 5J u r k a tT 细胞激活，检测T C R 磷酸化4 33 实验结果4 73 1 第一部分：细胞质膜及其电荷环境调控共刺激受体C D 2 8 的活化4 73 1 1C D 2 8 胞内段与酸性磷脂脂质双分子层结合4 73 1 2 活细胞F R E T 检测C D 2 8 胞内段与细胞质膜结合5 03 1 3C D 2 8 胞内段与酸性磷脂脂质双分子层结合引起
7、其构象变化一5 23 1 4C D 2 8 胞内段与酸性磷脂保护其酪氨酸残基不被磷酸化一5 63 1 5c a 2 + 促进C D 2 8 胞内段从酸性磷脂双分子层上解离。s 93 1 6C a 2 + 引起C D 2 8 胞内段酪氨酸残基从质膜上解离，并促进其磷酸化6 13 1 7C a 2 + 促进C D 2 8 与L c k 的结合6 33 2 第二部分：C a 2 + 引起T C RC D 3 C 亚基从质膜上解离，并促进其磷酸化6 43 2 1T C R 激活引起内流的c a 2 + 与T C R 共定位6 53 2 2C a 2 + 引起C D 3 c D 从脂质双分子层上的解离6
8、 93 2 3C a 2 + 促进T C R 的磷酸化7 33 2 4C a 2 + 正反馈调控T C R 磷酸化依赖于它的电荷属性7 73 2 5C a 2 + 对T C R 磷酸化的正反馈调控不依赖磷脂酰丝氨酸( P S ) 外翻8 23 2 6T 细胞中c a 2 + 正调控T C R 磷酸化不依赖于L c k 激酶活性的增强8 43 2 7C a 2 + 正调控T C R 磷酸化不依赖于酪氨酸磷酸水解酶S H P l 2 和C D 4 5的活性变化8 53 2 8 N M R 方法证明C a 2 + 和s P 直接与酸性磷脂的磷酸基团结合8 84 讨论。9 0声明9 7中国科学院生物化
9、学与细胞生物学研究所博士毕业论文C D 2 8 和T C R 的跨膜信号转导的机制研究参考文献9 8附录1 0 6缩略词1 0 6作者简历1 0 9已发表论文1 1 0致谢1 1 1中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士毕业论文C D 2 8 和T C R 的跨膜信号转导的机制研宄摘要中文摘要C D 2 8 和T C R 跨膜信号转导的机制研究磷脂分了在细胞质膜内外层的不对称分布使得质膜内层富含有多种带负电荷酸性磷脂，并形成带负电荷的微区( m i c r o d o m a i n ) 。已有报道表明，膜受体、离子通道、整合素等带正电荷的蛋白质与酸性磷脂问的静电相互作用对于其结构和功能至关
10、重要。T 细胞抗原受体( TC e l lR e c e p t o r ，T C R ) 和C D 2 8 是T 淋巴细胞表面的关键免疫受体，其中T C R 负责识别抗原并启动T 细胞活化的大部分信号，而C D 2 8 与其配体结合负责传递共刺激信号，这二者传递的信号通路对于T细胞的完全活化是必需的。目前T C R 和C D 2 8 接受配体刺激后的跨膜转导机制还不清楚。我t 2 _ 前的研究发现，在静息的T 细胞中，T C R 的c D 3 亚基通过其胞内段碱性氨基酸残基与细胞质膜内层酸性磷脂相互作用，保护其I T A M 模体不被L c k 磷酸化。C D 2 8 的胞内区与C D 3
11、9 类似，富含碱性氨基酸残基，因此我们推测其跨膜信号转导可能也受到细胞质膜的调控。通过生化实验、活细胞荧光共振能量转移以及液相核磁共振N M R 技术，我们发现C D 2 8 也通过其胞内区碱性氨基酸残基与细胞质膜内层上的酸性磷脂发生静电相互作用，其关键的酪氨酸残基被酸性磷脂腊质双分子层包埋而保护起来，不被激酶L c k 磷酸化。这解释了在静息状态下，C D 2 8 磷酸化信号维持在较低水平状态的原因。中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士毕业论文C D 2 8 和T C R 的跨膜信号转导的机制研究我第二部分的工作是研究T C R 和C D 2 8 胞内区在T 细胞激活后从质膜表面解离的分
12、子机制。我们的N M R3 1 P 谱检测结果发现，C a 2 + 可以与酸性磷脂的磷酸基团直接结合，中和酸性磷脂上的负电荷。在T 细胞中，T C R 初始激活会引起C a 2 + 的迅速内流，胞浆内整体钙浓度在数秒内上升1 0 倍以上，并日钙离子在其通道附近浓度更高。通过高分辨率T I R F M 显微成像技术和S p i n n i n g D i s k 成像技术，我们观察到T C R 初始激活引起C a 2 + 的内流在细胞质膜附近形成C a 2 + 微区( C a 2 + m i c r o d o m a i n ) ，且存免疫突触和周围与T C R 共定位。通过生化实验和活细胞荧光共振能量转移等技术手段，我们发现C a 2 + 引起C D 3 9 c D 从质膜上解离，使其关键性的酪氨酸残基暴露出来，进而增强T C R 的磷酸化。当用无生理功能的S P 取代C a 2 + ，我们发现S r 2 + 通过钙离子通道C R A C 进入细胞同样能够增强C D 3 磷酸化，这表明C a 2 + 对C D 3 代磷酸化的促进主要依赖于其电荷属性。T 细胞激活后，C D 2 8 与T C R 共定位于免疫突触中，T C R 激活引起的内流的c a 2 + 与C D 2 8 也存在共定位情
