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1、中国医科大学博士学位论文MMP-7基因及蛋白表达在胃癌侵袭和转移中的作用姓名：冯众一申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：徐惠绵2003.4.1M M P 一7 基因及蛋白表达在胃癌侵袭和转移中的作用中文摘要目的恶性肿瘤严重威胁人类的健康，肿瘤细胞向周围组织器官侵袭和转移 是恶性肿瘤最重要的生物学特性，也是肿瘤病人死亡的主要原因。肿瘤侵袭转移一直是肿瘤学研究的热点和难点问题。肿瘤侵袭和转移是受多基因产物调节的多步骤、多阶段过程，包括粘附、降解、运动和血管形成等。其中 蛋白水解酶对细胞外基质降解是导致肿瘤转移不可缺少的环节。因此，针 对蛋白酶在肿瘤侵袭和转移中的作用受到国内外学者的普遍关注。M
2、 M P 一7 ( m a t r i l y s i n ) 是基质溶解素的一种，基质金属蛋白酶家族中分子量最小的 成员，不仅具有其它M M P s 所具有的高度蛋白溶解能力及广泛的底物特异性，并在肿瘤血管形成中发挥重要作用。同时与其它基质金属蛋白酶不同 的是M M P 一7 主要为上皮源性肿瘤细胞高表达，基质不表达。M M P 一7 这种上皮源性肿瘤细胞增高表达的相对特异性有助于研究其在肿瘤侵袭、转移中的作用，并可能成为判断肿瘤细胞恶性生物学行为的一个指标。目前 关于M M PL 7 在胃癌发生发展中的作用的研究国外较多，国内很少。研究主要限于胃癌原发灶与浸澜深度、淋巴结转移及腹膜转移的关
3、系。腹水 M M P 一7 基因表达在腹膜转移中的直接作用的研究尚未见报道。本实验通过检测胃癌组织及腹腔冲洗液M M P - - 7 基因及蛋白表达，研究其与胃癌浸 润深度、淋巴结转移的关系及在腹膜转移中的作用，为临床应用蛋白酶抑制剂防治淋巴结及腹膜转移提供理论依据和治疗靶点。方法腹水或腹腔冲洗液标本收集：术中开腹后即刻于D o u g l a s 腔或右肝下置入一根1 6 号导尿管，注入无菌生理盐水1 0 0 毫升，轻轻搅动后抽出6 0 毫升。若有自然腹水则直接抽取。取腹水时尽可能避免出血，防止腹水中混入血液成分。抽取的腹水或冲洗液分成两等分在低温离心机中2 0 0 0 转分，离心1 5 分
4、钟。一部分上清液置于一7 0 。C 冰箱中冻存，沉渣涂片H E 染 色查瘤细胞；另一部分取沉渣立即加入1 毫升阿肋l 液进行总R N A 提取及反转录，将e D N A 置- 7 0 0 C 冰箱中冻存，以备P C R 扩增。l i t P C R 扩增：1 ) 总R N A 提取；2 ) 逆转录合成M M P 一7e D N A ；3 ) P C R 扩增M M P 一7 ；4 ) P C R 扩增产物的检测与半定量。其中T r i z o l 一步法总 R N A 提取。P C R 扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳银染。自动图象分析 系统分别对目的基因M M P 一7 及内对照G A P D
5、 H 的扩增产物条带进行分 析，通过M M P 一7 指数对M M P 一7 m R N A 进行半定量。M M P 一7 指数= M M P 一7 值G A P D H 值，M M P - 7 指数与其m R N A 含量呈正变关系。免疫组化染色：采用S P 法。微波修复处理。P B S 代替一抗作空白对 照，已知表达M M P 一7 乳腺癌切片作阳性对照。用正常兔血清代替一抗作阴性对照，参照S P 试剂盒说明书进行免疫组化染色。统计学分析：最后应用x 2 检验对免疫组化结果及t 检验对R T P C R 结果进行统计学分析。结果胃癌组织M M P 一7 基因及蛋白表达：M M P 一7 蛋
6、白几乎均为胃癌细胞胞浆或胞膜表达，阳性率为, 1 6 6 ，基质不表达，偶有正常胃粘膜上皮细胞 极弱表达。浸润深度透浆膜者M M P 一7 基因及蛋白表达显著高于未透浆膜者( P 5 0 者显著高于淋巴结转移度 5 个者M M P - 7 蛋白表达显著高于 5 个者显著高于 5 0 者显著高于3 0 ；3 统计学分析：采用x 2 检验( P 5 0 者M M P 一7 m R N A 表达水平( O 7 5d - O 2 1 ) 及蛋白阳性率( 8 0 ) 显著高于淋巴结转移度 5 个者M M P 一7 蛋白表达( 7 2 7 2 ) 显著高于 52 20 5 1 - 4 - 0 1 61 6
7、 ( 7 2 7 2 ) 淋巴结转移距离0 I 站2 30 1 8 0 0 73 ( 1 3 0 4 )I I 站或T2 20 8 34 - 0 2 3 1 8 ( 8 1 8 l ) 淋巴结转移距离度5 0 1 50 7 5 0 2 1 1 2 ( 8 0 0 0 ) P N ) 者可提高胃癌病人预后，延长生存期田瑚】。在基础研究中发现基质金属蛋白酶与多种肿瘤淋巴结转移密切相关，且转移淋巴结组织较原发肿瘤组织及无转移淋巴结增高表达2 加】。本实验研究发现M M P 一7 m R N A 及蛋白表达均与淋 巴结转移密切相关。淋巴结转移阳性者M M P 一7 m R N A 表达水平( 0 7
8、2 0 1 8 ) 及蛋白阳性率( 6 7 8 6 ) 显著高于淋巴结转移阴性者( 0 2 1 0 0 8 ；1 1 7 6 ) ( P 5 0 者M M P 一7 m R N A 表达水平( 0 7 5 0 2 1 ) 及蛋白阳性率( 8 0 ) 显著高于 5 个者( 0 4 O 1 4 ) 显著高于 5 0 者( 0 5 2 0 2 0 ) 显著高于 5 个者M M P 一7 m R N A 表达水平( 0 44 - 0 1 4 ) 显著高于淋巴结转移数目 5 0 者M M P 一7 m R N A 表达水平( O 5 2 0 2 0 ) ) 显著高于 5 0 者( O 1 5 O 0 7
9、 ) ( p O 0 5 ) 。以上结果的得出亦不是偶然的。目前认为胃癌腹腔脱落癌细胞形成通常有三个途径u 4 1 ：1 ) 最主 要的是癌细胞侵透胃浆膜脱落人腹腔。2 ) 淋巴结转移癌细胞侵透淋巴结被膜脱落入腹腔。3 ) 血行转移形成腹膜结节后脱落入腹腔。因此，可以得出发生淋巴结转移的程度越严重，则形成腹腔脱落癌细胞的可能性就越大， 腹水M M P 一7 删A 表达水平就越高。这与本研究结果相符合。3 2 三腹水M M P 一7 m R N A 表达与胃癌腹膜转移的关系 本实验结果显示腹水M M P 一7 m R N A 表达与胃癌浆膜分型及腹膜转移 密切相关。陈峻青副等研究发现胃癌浆膜受侵
10、穿透者呈腱状型及多彩弥漫型，外观貌似完整，电镜下却发现浆膜面不完整，细胞皱缩或缺失。该浆膜型与腹腔脱落细胞阳性密切相关，尤其浆膜受侵面积达3 0c m 2 以上者阳 性率为7 1 9 。本实验发现腱状型及多彩弥漫型者腹水M M P 一7 m R N A 表达( 0 4 6 0 1 4 ) 显著高于正常型，反应型及结节型者( 0 0 2 4 - 0 0 1 ) ( P 0 0 5 ) 。这与该型腹腔脱落细胞表达水平高相符合。进行期胃癌根治术后复发形式中腹膜转移约占4 0 5 0 ，是死亡的主要原因之一，严重影响病人预后。发生腹膜转移的途径是“：1 ) 癌细胞 浸透胃浆膜；2 ) 向腹腔脱落，在腹
11、腔内环境作用下形成有生物活性的脱落癌细胞E C C ；3 ) 与腹膜粘附着床，增殖形成癌结节。由此可见，腹腔脱落细胞存在是腹膜转移发生的先决条件之一。因此，发生腹膜转移者其腹水中 必然存在大量脱落癌细胞。与本实验腹水M M P 一7m R N A 在腹膜转移者表达( 0 6 3 0 2 7 ) 显著高于元转移者( 0 1 2 - t - O 0 5 ) ，且具有极显著差异( P 0 0 1 ) 相符合。腹水M M P 一7 表达不仅是腹膜转移的一种现象，而且M M P 一7 在腹膜形成中亦发挥重要作用。因为M M P 7 不仅具有基质降解作 用，还具有促血管形成和细胞增殖作用。在腹膜转移过程中
12、需要癌细胞粘 附在腹膜上并降解基质侵入腹膜深层，进一步细胞增殖及血管形成才能最终发生转移癌结节7 1 8 】。因此，腹水M M P 一7 表达在腹膜转移过程中具有重要意义。这一点在W i t t y 和P o w e l l 的研究中得到有力证实，他们分别将 转染M M P 一7 基因的结肠癌株和D U 一1 4 5 前列腺癌细胞株注入裸鼠体内发现腹膜结节形成显著增加。 由于腹水M M P 一7 m R N A 在大量脱落癌细胞存在时增高表达，因此在未形成临床腹膜转移结节之前，检测腹水M M P 一7 m R N A 表达就可能推测发生腹膜转移的危险性，为临床预测胃癌腹膜亚临床转移提供一种方法
13、。同时M M P 一7 在腹膜转移所起的重要作用，亦为临床应用蛋白酶抑制剂治疗腹膜转移提供一个靶点。3 3 结论1 腹水M M P 一7 m R N A 表达与胃癌淋巴结转移程度呈正相关。 2 腹水M N P 一7 m R N A 表达在腹膜转移中发挥重要作用。检测腹水M M P 一7 m R N A 为腹膜亚临床转移的诊断与治疗提供参考。3 4 研究结果的实际应用价值本实验研究通过R T P C R 方法检测了4 5 例胃癌腹腔冲洗液或腹水中 M M P 一7 m R N A 的表达情况。研究结果表明腹水M M P 一7 与胃癌浆膜分 型、淋色结转移程度和腹膜转移呈正相关。检测腹腔冲洗液或腹
14、水中M M P一7 m R N A 为腹膜亚临床转移的诊断与治疗提供参考。3 5 参考文献1L i o t t aL A T u m o ri n v a s i o na n dm e t a s t a s i s r o l eo ft h ee x t r a c e l l u l a rm a t r i x ：R h o a d sm e m o r i a la w a r dl e c t u r e C a n c e rR e s ，1 9 8 6 ，4 6 ：1 72S a t o hH ，儆T ，O k a d aY ，e ta 1 Am a t r i xm e t
15、 a l l o p r o t e i n a s ee x p r e s s e do nt h es u r f a c eo fi n v a s i v et u m o rc e i l N a t u r e ，1 9 9 4 ，3 7 0 ：6 1 6 53W o e s s n e rJ Fa n dT a p l i nC J P u r i f i c a t i o na n dp r o p e r t i e so fas m a l ll a t e n tm a t r i xm e t a i l o p r o t e i n a s eo ft h er
16、 a tu t e r u s JB i o lC h e m ，1 9 8 8 ，2 6 3 ：1 6 9 1 8 1 6 9 2 54M r p h yG ，C o c k e rM I ，W a r dR V ，e ta 1 M a t r i xm e t a i l o p r o t e i n a s ed e g r e = d a t i o no fe l a s t i n ，t y p eI Vc o l l a g e na n dp r o t e o g l y c a n aq u a n t i t a t i v ec o m p a r i -s i o n o ft h ea c t i v i t i e so f9 5k Da n d7 2 k Dg e l a t i
