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1、山东省医学科学院硕士学位论文常见致病真菌性角膜炎小鼠模型的建立姓名：王殿强申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：谢立信20060401学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。学位论文知识产权权属声明本人在导师指导F 所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东省医学科学院。山东省医学科学院享有以任何方式发表、复制、公丌阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文
2、或成果时，署名单位仍然为山东省医学科学院。1论文作者签名：二兰啦鲫一业立革垒 !兰2 0 0 6 胼堙 研究乍毕竹沦立常见致病真菌性角膜炎小鼠模型的建立山东省眼科研究所 研究生：王殿强 导师：谢立信教授【摘要J 目的真菌性角膜炎是一种严垂的敏直性跟瘸，发病宰呈明显上升趋势，占感染性眼病的比例逐年增大，近年我国多地区统计显示真苗性角膜炎已跃居感染性角膜疾病的首位而临床上对真菌性角膜炎的处理颇为棘手，缺乏低毒、特异、有效的抗真菌药物，部分患者在药物治疗期间病情加重，即便手术治疗仍有少数患者最终丧失眼球，因此，近年来i 幺病已引起眼科医生的关注。探索疾病治疗方法首先是进行基础研究，而进行基础研究的基
3、本途径就是建立杯准有效的动物模型，但是目前报道的多种方法存在缺少统一标准、感染率低、可重复性不高及依赖糖皮质激素等缺点因此本研究探索一种新的方法：改良角膜表层镜法，在不应用糖皮质激素和免疫抑制剂的情况下，建立常见致病真菌性角膜炎小鼠模型，以便为进一步进行基础研究尤其是免疫学和分子遗传学发病机制做准备，同时观察菌丝在小鼠角膜基质内的生长方式等特点。方法选取3 种临床常见的致病真菌：茄病镰刀菌、烟曲霉菌、白色念珠菌，近交系B A L B c 小鼠，应用改良的角膜表层镜法，即刮除角膜上皮，大鼠角膜片覆盖其上，二者层问注入菌液，缝合眼睑。按菌液浓度和闭台跟睑时间不同分组对比研究，拆除眼脸缝线后进行裂隙
4、灯检查，临床评分，刮片、组织病理学检查及角膜组织定量培养筛选最佳方法结果( 1 ) 白色念珠菌组：菌液浓度1 x 1 旷C F D m 1 闭合眼腧4 9 h ，小鼠角膜感染率1 0 0 ，角膜溃疡重持续时间长( 8 天) ，P A S 染色见大量菌丝，菌丝生长方式总体上呈垂直生长趋势，浸澜角膜深基质层，甚至穿透角膜进入前房，角膜易穿孔，前房炎症反应重。真菌培养阳性，定量培养角膜内真菌数量随时问推移逐渐减少( 2 ) 烟曲霉菌组：菌液浓度l 1 0 S C F U m l ，闭合眼睑7 2 h ，小鼠角膜感染率8 3 3 ，但轻重不等，持续时阃长短不一( 4 一S 天) ，且发现溃疡呈全板层剥
5、离现象，角膜缘新生血管增生早且迅速，溃疡自愈倾向明显，P A S 染色见菌丝浸润角膜全层，生长方式总体上呈垂直生长趋势，真菌培养阳性。( 3 ) 茄病镶刀菌组：菌液浓度i x l 0 S C F I7 佃J ，闭合跟腧7 2 h ，小鼠角膜感染率9 1 7 ，均为重度感染，持续时问长( 8 天) ，P A S 染色见菌丝生长方式总体上呈垂直生长趋势，且易穿透角膜进入前房，甚至穿透晶体囊膜浸润晶体皮质。角膜组织定量培养真菌数量逐渐减织结构、宿主的防御能力及其与真菌毒力的相互抑制剂情况下，改良角膜表层镜法可以成功诱导白色念珠菌和茄病镶刀菌感染B A L B c 小鼠角膜炎，可以用于真菌性角膜炎发病
6、机理兕其免疫学及分子尘物学等机制的研究；烟曲霉菌致B A L B c 小鼠角膜感染窜十H 对较低，自愈较迅速，可第2 奥2 0 0 6 解倾ll ! I f 究乍毕廿沦殳以扩大样本增加感染数麓用于早期发病机制研究。( 2 ) 三种真菌菌丝在B A L B e小鼠角膜摹质内，上长方式总体上均鬯垂直尘长趋势。( 3 ) 与以往真苗性角膜炎兔模型研究对比发现，同一菌株 0 0 5 ) ，接种第8 天比较差异无统计学意义( t = O 7 8 1 8 。P O 0 5 ) 。各组感染率及临床评分见表3 a ，3 b 。( 二) 角膜溃疡刮片B 、D 组接种第2 、4 天溃疡刮片可查见菌丝( 图1 1
7、) ，刮片组织真菌培养阳性，浸润轻者未查见菌丝c 、E 组接种第3 、4 、5 天均可查见菌丝，真菌培养阳性，溃疡旱板层剥脱后未查见菌丝，各组细菌培养均阴性。( 三) 组织病理学检查B 、C 、D 、E 组接种第4 天P A S 染色均见菌丝( 图1 2 a ) ，接种第8 天未查见菌丝。菌丝浸润角膜全层，基质内菌丝呈较耔l 短透明管状或棒状，多为有隅菌丝，成簇分布，后弹力层前较密集，头端膨大呈串珠状，少鼍穿透后弹力层进入自口虏，第1 2 贝2 0 0 6 届颂士研究生毕业论文角膜基质内菌丝生长方式总体上呈垂直生长趋势H E 染色角膜及前房大量炎症细胞浸润( 图1 2 b ) ，前房积脓明显，
8、菌丝集中处( 角膜溃疡灶) 炎症细胞较少，溃疡周围炎症细胞密集，随时间延长炎症细胞数量逐渐减少表3 盘烟曲霉菌各组感染率及临床评分表( 四) 角膜组织匀浆定量培养B 组接种第3 天真菌培养阳性，C 、D 、E 组接种第3 、5 天真菌培养阳性( 图1 3 ) ，第8 天真菌培养均阴性，细菌培养均阴性。各组培养真菌菌落数见表4 。第1 3 页2 0 0 6 厢硕I 。研究个毕竹论史表4 角膜组织定带培养烟f l 霉菌荫落数第l l l 部分茄病镰刀菌( ) 实验分组随机将4 2 只小鼠分成4 组，右眼为实验眼。A 组：6 只，对照组，生理盐水，闭合眼喻7 2 小时B 组：1 2 只，标准株，1
9、0 S C F U m | ，闭合眼腧4 8 小时C 组：1 2 只，杯准株，1 0 8 C F U m l ，闭合眼腧7 2 小时D 组：1 2 只，临床株，1 0 S c F U m l ，闭合眼睑4 8 小时二，观察结果( 一) 裂隙灯观察及临床评分A 组( 对照组) 角膜上皮愈合，无明显水肿和混浊，角膜缘无新生血管生长，虹膜纹理清晰。B 组感染率6 6 7 ( 8 1 2 ) ，角膜感染轻重不等，轻者为浅表浸润，虹膜及瞳孔隐约可见，重者局部深基质浸润，可见内皮斑，溃疡周围可见伪足，表面灰白色稀薄苔被覆盖，4 5 天时溃疡最重，凹凸不平，局部增生明显，同时角膜缘新生血管长入，轻者l 周左
10、右溃疡逐渐修复。c 组感染率9 1 7 9( 1 1 1 2 ) ，重度感染，角膜溃疡重( 图1 4 ) ，呈黄白色或灰黄色，边界不清，凹凸不平，表面黄白色苔被附着，局部增生突起明显，溃疡明显处变薄，未见穿孔，略轻者局部可见内皮斑，前房积脓，隐见虹膜，大部前房情况不见，接种第4 6 天溃疡加重明显，角膜迸一步变薄，表面稀薄黄白色苔被附着，1 只穿孔( 8 - 3) ，轻者l 周左右隧新生血管长入溃疡开始修复( 图1 5 ) 。D 组感染率7 5 9( 9 1 2 ) ，接种第2 天角膜感染轻重不一，随时f B j 推移溃疡加重明显轻度浸润者逐渐形成明显溃疡，4 5 天最重，同时新生血管长入，8
11、 天溃疡丌始修复。B与C 组接种第3 天临床评分比较差异有统计学意义( t = 3 0 6 1 9 ，P 0 0 5 ) ，C 组接种第3 天与第3 天临床评分比较差异有统计学意义( t = 4 9 3 6 5 ，P 0 0 5 ) 。各组感染率及临床评分见表5 a ，5 b 。( 二) 角膜溃疡刮片B 组接种后第2 、3 天溃疡明显者可查见蒲丝，溃疡刮取物培养真菌和细菌均为阴性，D 组于接种第2 、3 、4 天查见菌丝，第2 天真菌培养阳性，细菌阴性。钨1 4 虹2 0 0 6 届硕士研究生毕业论文C 组于接种第3 、5 、7 天均查见菌丝( 图1 6 ) ，真菌培养均阳性，细菌培养阴性。表
12、5 a 茄病镰刀菌各组感染率及临床评分表( 三) 组织病理学检查B 组接种第4 天P A S 染色见角膜基质内少量菌丝，H E 染色见基质及前房大量炎症细胞浸润C 组接种第4 天P A S 染色见角膜全层大量菌丝( 图1 7 a ) ，部分穿透角膜进入前房，甚至穿透晶体囊膜进入晶体皮质内( 图1 7 “ o ) ，角膜基质及进入眼内菌丝形态无明显差别，多为有隔菌丝，均较长、直，分枝少，基质内菌丝总体上呈垂直生长趋势；第8 天基质内仅见少量菌丝( 图1 7 c ) 。H E 染色( 图1 7 d ) 角膜基质及前房内见大量炎症细胞浸润，包围在菌丝周围，角膜溃疡周边大量炎症细胞，8 天时角膜周边新
13、生血管生长( 图1 7 e ) ，晶体囊膜水肿增厚，周围炎症细胞浸润，重者晶体皮质溶解。D 组接种第4 天P A S 染色见稀疏菌丝散第1 5 页2 ) 0 6 刷硕I 埘f 究牛牛廿论文在分靠于角膜基质及前房内，部分穿透晶体鬟膜，H E 染色角膜苍质及前房炎射；细胞枝涧。集中于葫丝周蹋，角膜明显变薄。( 四) 角膜组织匀浆定量培养B 组接种后第3 天真菌培养阳性，第5 天未见真菌生长。C 组3 、5 、8 天真菌培养均阳性( 图1 8 ) ，D 组3 、5 天真菌培养阳性，8 天未见真菌生长，细菌培养均阴性如表6 示。表6 角膜组织定量培养茄病镰刀菌菌落数( C F U )讨论一，人类疾病动
14、物模型的重要性和设计原受1 j 【2 3 2 - 4 1人类疾病动物模型( a n i l a lm o d e lo f h u m a nd i s e a s e ) 是指医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料人类疾病的发生和发展是十分复杂的，把人作为实验对象来推动生命科学的发展是有局限性的，许多实验也不可能在人体上进行动物模型可以拟补这些不足。目前，动物模型已成为现代医学认识生命科学客观规律的主要工具，有助于研究者更深刻的认识疾病的发生，发展规律和采取更有效的防治措篪。建立有效的动物模型一般应遵循以下原则：相似性，重复性、可靠性、适用性和可控性、易行性和经济性建立
15、有效的真菌性角膜炎动物模型，是进行真菌性角膜炎基础研究，探索发病机理，寻找有效治疗靶点的关键一步。但是，在眼部真菌病的研究中，大多数动物郡对常见致病真菌表现出抗病性，加上真菌种类繁多，本身复杂生活周期，因此建立有效的真菌性角膜炎动物模型一直是研究的热点和难点。二、建立真菌性角膜炎动物模型的方法( 一) 目前报道的方法及存在的问题目莳国内外报道的真菌性角膜炎动物模型所采用的方法包括角膜基质注射法I 悼J 6 1 ，针蒯划痕法l l l j 及角膜接触镜法J I7 l 等，选取的动物主要足兔，大鼠及小鼠，研究菌种主要集中在发达国家常见的白色念珠菌，但是接种苗液浓度参差不齐，相差悬殊( 1 扩一1
16、0 o C F U m 1 ) ，为了提高真菌感染率和维持时f B J ，人多数动物术薹；1 6 虹2 0 0 6h t l 碗 研究审毕廿论炙d 口应用糖皮质激素或免疫抑制剂处理。仍足这螳方法均不能真实模拟人角膜感染真荫的自然病张，肇质江射希I 针刺划痕法破坏了角膜的I F 常结构，井H 针刺造成角膜表面的创伤深浅不一，无统一的标准；糖皮质激素和免疫抑制荆改变了动物的全身及局部免疫状态，改变了局部炎症细胞和细胞因f 的分靠，人为的干扰了真菌毒力与宿毛i F 常l l l ! 御力相互作用的过程，所以增加了真菌感染的病因学、发病机制、组织病理学、免疫学及分孑生物学等方面研究的局限性和不确定位。( 二) 角膜表层镜法角膜表层镜法为我所首创，曾庆延等1 1 9 ，2 0 1 曾应用于建立兔角膜真菌感染的动物模型，真实模拟真菌自表面感染角膜的过程，达到了良好的效果。此方法刮除角膜上皮，去除了上皮屏障，降低了宿主的防御能力，增加了真菌的易感性，符合人
