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1、GE HealthcareAmersham ECL Prime 蛋白印迹试剂数据文件 28-9857-23 AA蛋白印记试剂自从1990年进入市场以来，增强化学发光（ECL）蛋白印记系统产品库不断丰富，以适应从常规蛋白检测到采用基于荧光Amersham ECL plex进行多道分析的各种应用。通过选择ECL检测系统，研究人员不仅可以避开对人有危害的放射性同位素操作，同时还拥有了另外的分析工具，正是由于这种分析具有一次性的特点，使得蛋白分析比以前变得更加快速，更加敏感，也更加地灵活。Amersham ECL家族最近加入的成员是ECL prime，它至少具有ECL plus两倍的敏感性，其最低检测
2、限（LOD）可达低皮克量级。该试剂的特点在于大幅增加了信号的稳定性，这使得反复曝光变成可能，并使其能在一个试验中轻松地进行多个印记处理。此外，ECL prime所发射的信号强度提高了3到5倍，这也就意味着ECL prime也采用比ECL plus低3倍的一抗和二抗进行检测，这不仅降低了背景，并使抗体试剂的费用得到降低。ECL Prime保留并增强了Amersham ECL plus和Amersham ECL Advance的优势，提供出一套敏感、稳定、在很宽蛋白动态水平范围内能精确定量并在节省昂贵的抗体试剂成本的检测系统：信号强度高且灵敏，允许使用高度稀释的一抗和二抗而 不降低灵敏度信号稳定，
3、可重复曝光，非常适合大量实验的开展，客 户可以从容地安排实验和检测之间的时间图1. Amersham ECL Prime：GE Healthcare的一种新的、高灵敏化学发光蛋白印记试剂。最适合于ImageQuant LAS 4000（CCD成像）成像，也 可与Amersham Hyperfilm匹配使用可与Rainbow分子量标准和Amersham ECL Dualvue蛋 白印记标准配合使用最适合选用Amersham Hybond-P（PVDF）膜，也可使 用Amersham Hybond-ECL（硝酸纤维）膜化学发光蛋白检测ECL prime可检测出蛋白印记实验中极微量的蛋白质。信号为发
4、射光（化学发光，见图2），其信号强度与检测蛋白量成正比，可以给出单次印记在很宽蛋白水平范围的精确数据。辣根过氧化物酶（HRP）可催化鲁米诺发生氧化，从而产生425 nm波长的化学发光。与其他化学发光试剂相比，ECL prime在实际中加入了增强剂，可以增加酶活力，从而大幅提高了信号强度和持续时间。通过加入催化剂可以进一步增强发光信号。Amersham ECL Prime在蛋白免疫印迹中的应 用ECL Prime主要在蛋白免疫印迹流程的检测阶段发挥作用（图3），同时对上游的步骤也有一定的影响。比如， ECL Prime作为检测方法时可以采用高度稀释的一抗作为与免疫印迹膜杂交的探针。这不仅在经济上
5、非常合适，也避免了背景信号下淹埋的与目的蛋白之间的较弱特异结合。ECL的高灵敏度要求其不仅能封闭非蛋白结合位点，并且能被清洗步骤彻底清除。图2.ECL prime与偶联在二抗上的HRP之间的反应。HRP可催化ECL prime试剂向感光分子转化，感光分子被氧化产生受激产物，受激产物衰变时产生光信号。图3.蛋白印记流程中的ECL Prime。图中所列为最典型的蛋白印记实验。某些特定步骤附加的产品来自GE Healthcare产品库，提供整个蛋白印记流程的解决方案，所有产品都经过优化，可以配合使用。HRPECL Prime? ?ECL DualVue ? Rainbow ?Amersham Hyb
6、ond-P Amersham Hybond-ECLECL prime ?Amersham ECL HRP ?ImageQuantLAS 4000? Hyperfilm ECLIQTL?Amersham ECL primeAmersham ECL prime：性能特点灵敏度和精确度与ECL plus相比，ECL prime更加灵敏，且在很宽的蛋白水平范围内呈现线性信号响应。图4结果为加ECL prime 75秒后曝光以及加ECL Plus 3分钟后曝光。结果表明ECL prime在灵敏度方面增加了4倍（见图4的LOD），且线性动态范围有明显的改善，这使得同一印迹膜上无论高或低丰度的蛋白都能在单次
7、曝光后被检测出来并精确定量。样品：对2.5 ng转铁蛋白进行2倍梯度稀释膜：Amersham Hybond-p封闭：ECL prime封闭剂(ECL prime)和5%脱脂干奶粉(ECL plus)一抗：兔抗转铁蛋白(1:3000)二抗：HRP偶联的抗兔IgG(1:30000)检测：Amersham ECL prime/ Amersham ECL plus成像：ImageQuant LAS 4000 mini(其中Amersham ECL prime成像需 要75秒， Amersham ECL plus成像需要3分钟)LOD：2.4 pg(ECL prime)，9.8 pg(ECL plus)
8、动态范围(DR)： 3个数量级(ECL prime), 2.4个数量级(ECL plus)图4.分别用ECL prime（上栏）和ECL Plus（下栏）对2倍梯度稀释的转铁蛋白进行蛋白免疫印迹检测。样品印迹在Amersham Hybond-p（PVDF）膜上，并通过ImageQuant LAS 4000 mini系统进行成像。信号稳定性ECL prime产生的化学发光信号非常稳定，即使对于所检测的最小量的蛋白质，其信号依然能在加入试剂后三小时内维持足够强度，这使得重复曝光成为可能，并且能在每次实验和分析之间轻松地安排时间（图5和表1）。经过ECL prime处理1小时后，大约还剩下60%的信
9、号，而ECL plus处理则只剩下15%。样品： 对2.5 ng转铁蛋白进行2倍梯度稀释膜：Amersham Hybond-p封闭： 5%牛血清白蛋白，溶解在PBS-T溶液中一抗： 兔抗转铁蛋白(1:3000)二抗： HRP偶联的抗兔IgG(1:30000)检测： Amersham ECL prime/ Amersham ECL plus成像： ImageQuant LAS 4000 mini(所有时间点都进行3分钟成像)图5.加入ECL prime 3小时内各个时间点的信号强度进行并排比较。同时对ECL试剂处理相同时间的效果进行比较。表1.试剂加入后3小时内各个时间点的残留信号强度。对每组中
10、第4条带（0.312 ng转铁蛋白）进行分析，每个时间点曝光时间为3分钟。时间点（min）残留信号强度（%0时间点）Amersham ECL PrimeAmersham ECL Plus0 100 10030 76 2960 61 1590 42 7120 32 5150 24 3180 19 2020004000600080001000012000Transferrin (ng)Integrated Intensity ( 10-4)00.511.522.53ECL Prime 2.5 ng 2.4 pg 0400800120016002000Transferrin (ng)Integrat
11、ed Intensity ( 10-4)00.511.522.53ECL Plus2.5 ng 9.8 pg Time (min) ECL Prime ECL Plus03060901201501802.5 ng4.9 pg 2.5 ng9.8 pg有效利用抗体使用ECL prime可以检测到ECL plus检测不到的更低的蛋白量，即使一抗经过高度稀释，这种可能性仍然存在（图6）。ECL prime中采用1:10000（一抗）和1:50000（二抗）的抗体稀释与ECL plus采用1:3000和1:30000的抗体稀释所得到的信号强度和LOD类似。样品： 对10 g的NIH 3T3细胞裂解总蛋
12、白进行2倍梯度稀释膜：Amersham Hybond-P封闭： 5%牛血清白蛋白，溶解在PBS-T溶液中一抗： 兔抗-catenin(1:3000到1:10000)二抗： HRP偶联的抗兔IgG(1:30000到1:50000)检测： Amersham ECL prime/ Amersham ECL plus成像： ImageQuant LAS 4000 mini(一抗1:3000或1:5000稀释时需5分钟，一抗 1:7000或1:10000稀释时需7分钟)图6.对ECL prime和ECL plus在NIH 3T3全细胞裂解物来源的2倍梯度稀释样品，采用不同稀释倍数的兔抗-catenin和
13、HRP偶联的抗兔IgG进行免疫印迹检测时的效果进行比较。产品兼容性Amersham ECL Prime经过改良，配合GE Healthcare的蛋白印记套餐产品使用，可发挥出最佳的性能，例如Amersham Hybond-p膜。当然，Amersham ECL prime也能与其他蛋白免疫印迹试验中常用的试剂匹配使用。例如，使用硝酸纤维Amersham Hybond-ECL膜同样能获得不错的效果，此外对于ECL prime使用，不需要特殊推荐某种分子量标准或封闭试剂。细胞裂解物中不同靶蛋白水平的相对定量具有高度灵敏的ECL prime试剂配合具有极宽动态范围的CCD成像仪如ImageQuant
14、LAS 4000 mini，在同一次印记中通过非调节管家蛋白进行标化，可以对目标蛋白进行可信度极高的相对定量（图7）。通过检测管家蛋白的表达水平，可以判断每一泳道是否加入了相似量的总细胞裂解物。样品： 10 g的NIH 3T3细胞裂解物(IFNa处理/不处理细胞以一定比例混合)或 Hela细胞裂解物(茴香霉素处理/不处理细胞以一定比例混合)总蛋白膜：Amersham Hybond-p封闭： 5%牛血清白蛋白，溶解在PBS-T溶液中一抗： 兔抗-catenin(1:3000)，小鼠抗pSTAT3(1:3000)或小鼠抗肌动蛋白 (1:3000)二抗： HRP偶联的抗兔IgG(1:30000)或H
15、RP偶联的抗小鼠IgG(1:30000)检测： Amersham ECL prime成像： ImageQuant LAS 4000 mini(3分钟，-catenin；1分钟，肌动蛋白)图7.免疫蛋白印记法检测（A）5种不同NIH 3T3细胞裂解物中-catenin和（B）5种不同Hela细胞裂解物中Tyr705磷酸化STAT3（pSTAT3）的表达水平。每个实例都对同一次免疫印迹中目标蛋白以肌动蛋白水平进行标化和相对定量。值得注意的是，虽然-catenin的水平在印记的视觉检测上非常相似，但通过ECL prime和ImageQuant LAS 4000 mini分析仍能找到之间明显的差异。Ab dilution ECL Prime ECL PlusPrimary Secondary 1:3000 1:30 000 1:5000 1:30 0001:7000
