高纯度质粒小提中量试剂盒

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1、 TRIpure Reagent 抽提指南抽提指南 目录号目录号 RP02 使用手册使用手册 实验室使用，仅用于体外实验室使用，仅用于体外 TRIpure Reagent 抽提指南抽提指南 目录号目录号 RP02 使用手册使用手册 实验室使用，仅用于体外实验室使用，仅用于体外 TRIpure Reagent 抽提指南抽提指南 目录号目录号 RP02 使用手册使用手册 实验室使用，仅用于体外实验室使用，仅用于体外 高纯高纯度度质粒小质粒小提中提中量试剂盒量试剂盒 目录号目录号 1218 使用手册使用手册 实验室使用实验室使用，仅用于体外仅用于体外 - 1 - 高纯度质粒小高纯度质粒小提中提中量试

2、剂盒量试剂盒 目录号：目录号：1218 适用范围：适用范围： 适用于5-15ml 中等规模质粒制备（mind preparations） 试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成试剂盒组成 保存保存 50 次次（121801） RNase A （10mg/ml） 20 250 l 溶液溶液 P1 4 25 ml 溶液溶液 P2 室温室温 25 ml 溶液溶液 P3 室温室温 35 ml 去蛋白液去蛋白液 PE 室温室温 16ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇第一次使用前按说明加指定量乙醇 漂洗液漂洗液WB 室温室温 15 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇第一次使用

3、前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液洗脱缓冲液 E B 室温室温 10ml 吸附柱吸附柱 AC 室温室温 50 个个 收集管（收集管（2ml） 室温室温 50 个个 本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。 - 2 - 储存事项： 1. 第一次使用时， 将试剂盒所带的全部第一次使用时， 将试剂盒所带的全部 RNase A 加入溶液加入溶液 P1后 （终浓度后 （终浓度 100ug/ml）置于置于 2-8保存。保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的质粒可能会有微量 RNA残留，在溶液 P1 中补加 RNase A 即可。 2. 环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出浑浊

4、或者沉淀，可在 37水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 4. 产品介绍：产品介绍： 本试剂盒采用改进 SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。 产品特点：产品特点： 1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定

5、的弊端。 2. 独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌株如 JM 系列、HB101 也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。 3. 快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好， 可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 - 3 - 注意事项注意事项： 1. 所有的离心步骤均在室温完成，所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2. 溶液P3和去蛋白液PE中含有刺激性化合物， 操作时要戴乳胶手套，

6、避免沾染皮肤避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。 3. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议取取5-15 ml 过夜培养过夜培养14-16个小时个小时的菌液的菌液，可提取出多达50g-60g的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用10-20 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步骤相同。 4. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50g/

7、ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条条或者多条DNA条带，条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过旋可以超过90%。 5. 质粒质粒DNA确切分子大小，确切分子大小， 必须酶切线性化后，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。 6. 洗脱液洗脱液EB不含有螯合剂不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用

8、水洗也可以使用水洗脱，但应该确保脱，但应该确保pH大于大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在20。 质粒DNA如果需要长期保存， 可以用TE缓冲液洗脱 （10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0） ，但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。 - 4 - 操作步骤：操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）（实验前请先阅读注意事项） 提示：提示： 第一次使用前请先在漂洗液 WB 和去蛋白液 PE 瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! 将 RNase A 全部加入溶液 P1 中，混匀，每次使用后置于 2

9、-8保存。 将溶液 P3 放在冰上预冷。 1. 取 5-15 ml 过夜培养的菌液，9,000rpm 离心 1-2 分钟，尽可能的倒干上清，收集菌体。 2. 用 500l 溶液 P1 重悬菌体沉淀， 涡旋振荡至彻底悬浮， 全部转入一个 2ml 离心管。 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 3. 加 500l 的溶液 P2，温和地上下翻转 4 -7 次使菌体充分裂解，室温放置 4 分钟。 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组 DNA 剪切断裂！所用时间不应超过剪切断裂！所用时间不

10、应超过 5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的稠后就可以做下一步，不是一定要准确的 5分钟。分钟。 4. 加 700l 溶液 P3， 立即温和地上下翻转 4 -7 次， 充分混匀时会出现白色絮状沉淀。冰上静置 3-5 分钟，13,000rpm 离心 10 分钟，小心取上清。 加入溶液加入溶液 P3 后应该立即混匀，以免产生后应该立即混匀，以免产生 SDS 的局部沉淀。如果上清中还有微小的局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。白色沉淀，可

11、再次离心后取上清。 5. 将上一步所得上清分次加入吸附柱 AC 中 （吸附柱放入收集管中） ， 13,000rpm 离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液。 6. 可选步骤可选步骤:加入 500l 去蛋白液 PE，13,000rpm 离心 30-60 秒，弃废液。 此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为 JM系列、系列、HB101 等等 endA 菌菌- 5 - 株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为 XL-1 Blue 和和DH5 等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可略过

12、此步骤。等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可略过此步骤。 7. 加入 700l 漂洗液 WB （请先检查是否已加入无水乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!） ， 12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。 8. 加入 500l 漂洗液 WB，12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。 9. 将吸附柱 AC 放回空收集管中，13,000rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 10. 取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位在吸附膜的中间部位加 100l-250 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 65-70水浴中加热效果更好） ，室温放

13、置 2-5分钟，12,000rpm 离心 1 分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心 1 分钟。 洗脱体积越大， 洗脱效率越高。 如果需要质粒浓度较高， 可以适当洗脱体积越大， 洗脱效率越高。 如果需要质粒浓度较高， 可以适当减少洗脱体积，减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于但是最小体积不应少于 80l，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。 - 6 - 问题与解决方法问题与解决方法 问题问题 评论与建议评论与建议 质粒 DNA 产量低 *忘加抗生素，非质粒转化细胞过度生长-建议：建议：确保固体、液体培养基中都加入了适当的

14、抗生素。 *细菌培养时间太长，老化细菌开始裂解-建议：建议：接种过夜培养的新鲜单菌落于加了合适抗生素的培养基中，培养 12-16 个小时。 *使用了低拷贝数质粒-建议：建议：使用高拷贝数质粒，低拷贝数质粒应该适当加大处理体积。 *细菌培养时间过短，细菌浓度过低-建议：建议：细菌培养到A600吸光值为2-4 时，收集菌体。 *细菌细胞裂解不完全-建议：建议：使用建议的菌体处理量，不要过量；涡旋或者吹打，确保菌体充分重悬于溶液P1 中， 不应该见到未散开的细菌团块；加入裂解液P2 后，应该是粘稠和透明的。 *质粒 DNA 产量使用分光光度计定量不准确-建议：建议：分光光度计定量常常偏高，使用琼脂糖

15、电泳/EB 染色定量。 *洗脱效率不高-建议：请阅读操作步骤建议：请阅读操作步骤 9和注意事项和注意事项 6。 未提取到 质粒 DNA *漂洗液WB 中忘加无水乙醇-建议：第一次实验时，在漂洗液建议：第一次实验时，在漂洗液 WB中中加入指定量无水乙醇加入指定量无水乙醇 *质粒洗脱液含有较多乙醇，琼脂糖电泳/EB染色定量时质粒 DNA漂出上样孔-建议：建议：确保已经做了步骤 9，将离心吸附柱的残留乙醇去除；或者适当提高上样缓冲液浓度。 - 7 - 问题问题 评论与建议评论与建议 质粒 DNA 下游酶切不能 切开或者酶切不完全 *忘记做步骤 9， 乙醇抑制了酶切反应-建议：建议：做步骤 9， 然后

16、空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。 *一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应-建议：建议：将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心1分钟， 小心取上清使用。 质粒 DNA 降解或者无质粒 DNA *核酸酶活性太高-建议：建议：确保已经做了步骤6，使用去蛋白液PE去除核酸酶。 基因组DNA 污染 *裂解时基因组 DNA 被剪切打断了-建议：建议：做步骤 3 时，轻柔颠倒混匀，不要涡旋或者剧烈震荡。不要涡旋或者剧烈震荡。 质粒 DNA 缺口或者电泳时超螺旋带前出现变性质粒带 *步骤3 裂解时间过长-建议：裂解时间不要超过建议：裂解时间不要超过 5 分钟。分钟。 产物中含有 RNA 污染 *第一次做实验时， 忘记将 RNase A 加