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1、日期：2012 年 10 月 19 日创造由化学合成基因组控制的细菌细胞创造由化学合成基因组控制的细菌细胞2010 年 5 月 20 日，美国科学杂志上有一篇研究论文名为“创造由化学合成基因组控制的细菌细胞” ， 其内容摘要为： 克雷格 文特尔私人研究机构从基因测序信息数据化开始，报道含有 1,080,000 个碱基对的蕈状支原体 JCVI-syn1.0 基因组的绘制、合成和组装，并且把它移植进一个山羊支原体受体细胞中，创造一个仅仅由（化学）合成的染色体组控制的新的蕈状支原体细胞。该细胞中，唯一的 DNA 就是那有计划合成的 DNA 序列，包含“水印”序列和其他在构建过程中所需的基因删除、多态
2、性和变异。背景：背景：作者表示，此前科学界对基因组，尤其是基因组的功能，知之甚少。自从 1977 年桑格（Sanger）及其同事确定了噬菌体X174 的完整基因密码，即世上第一个 DNA 基因组完整测序成功以来，生物基因组的测序成果呈指数型增长，从而产生了数不清的基因组信息数据。然而，即使一个单细胞系统的基因及其对应生物功能都还没有搞清楚。因此，作者提出了一个研究思路：在简单的单细胞生物细菌中，染色体是否已经包含正常生命活动所需的全部指令？如果真是这样的话，能否将计算机中的基因组序列用化学合成的方法得到一个能够复制的完整基因系统？整个团队用了 15 年时间，致力于人工合成 DNA 大分子和染色
3、体，并用来构建一个最小的只是包含必需基因的细胞。他们选用的含有已知生物中最小基因组的单细胞生物生殖支原体，它的 485 个编码蛋白质的基因中有超过一百个不是必要的。他们最终得到了“由化学合成基因组控制的细菌细胞” 。然而，他们的研究并不是一帆风顺的。在当时，人工化学合成只能得到平均 6kb 大小的 DNA 片段，如何将这些小片段组装起来得到 DNA 大分子呢？他们研究得到一种方法：将化学合成的全部 DNA 小片段导入酵母菌中利用同源重组拼接成大片段，多次进行最终得到完整的基因组。其中，还需利用大肠杆菌扩增、筛选。然而，将化学合成的基因组移植进受体细胞并成功表达也有不少的障碍。例如，如何完整地从
4、酵母菌中提取出染色体？如何将合成的基因组移植进受体细胞，并且建立一个仅由外来基因组控制的细胞？而且，生殖支原体的生长速率及其缓慢。研究团队重新选择了生长比较快的蕈状支原体作为基因组供体，山羊支原体作为人工合成的基因组受体作进一步研究。尽管克服了上述困难，在移植蕈状支原体天然 DNA 的时候，他们成功地得到了完全由蕈状支原体基因组控制的山羊支原体，但为什么改用化学合成的蕈状支原体基因组会导致失败呢？研究继续进行，他们最后发现蕈状支原体和山羊支原体共用一套“抵御系统” ，天然的蕈状支原体基因组已经被甲基化，能够使该基因组被山羊支原体接受。因此，化学合成且在酵母菌中拼接而成的基因组需经过甲基化酶修饰
5、。研究结果最终证明，在简单的单细胞细菌中，染色体上有其正常生命活动所需的全部指令信息。主要研究结果：主要研究结果：实验步骤简单概括为如下 4 个方面：1)合成供体的基因组 DNA：首先，将蕈状支原体的全基因组测序，并按照该序列信息将其合成为 1 078 条平均长度为 1 080bp 的 DNA 片段。 这些片段两两间具有 80bp 的部分重叠， 所有片段拼接起来构成蕈状支原体的全长基因组。值得注意的是这些合成的片段较天然基因组略有一些改动，包括去除了 14 个不重要的基因、为阻断基因而设计的两个插入序列、27 处单核苷酸多态性 (其中 19 处在意料之中) 以及 4 条用来区分于天然序列模本的
6、“水印”标记 ，这些改动都不影响细胞正常的生命活动。该过程涉及到计算机对合成序列的精密计算。2)合成 DNA 片段的拼接：将以上合成的 1 078 条 DNA 片段分别连接到载体，使其能在酵母细胞中通过同源重组拼接起来。于是，平均 1 080bp 的 DNA 片段，10 个一组拼接为大约 10 kb 的片段(109个)，然后将这些连接有目的基因片段的载体从酵母中分离出来，转入大肠杆菌 E. coli 中进行扩增，以限制酶筛选出阳性克隆；之后再将阳性克隆质粒中的这 109 条 10 kb 左右的片段按同样的方法每组 10 个拼接成 100 kb 的片段 (11 个)；这 11 条片段最终拼接成完
7、整的总共 1 077 947bp 的基因组 (由于携带太大片段的载体在 E. coli 中不能稳定传代，因此后两步拼接中采用多重 PCR 来筛选阳性克隆)。此过程除了 2 个衔接反应是在体外用酶处理构建，其余所有的片段都是在酵母细胞内依靠同源重组拼接而成。3)人工基因组的甲基化修饰：由于供体细胞(蕈状支原体) 和受体细胞 (山羊支原体) 共用同一套限制酶系统，而天然的供体基因组是经甲基化修饰的。因此，拼接完成的基因组 DNA 还需在体外用甲基化酶 (从蕈状支原体或山羊支原体提取物中纯化) 进行修饰，以避免受体细胞限制酶系统的阻碍。4)人工基因组移植入受体细胞：将构建好的人工合成基因组移植入山羊
8、支原体内。细胞经过不断分裂传代，具有人造基因组的细胞在含抗生素的培养基中筛选出来，同时含有天然 DNA 的细胞逐渐消失殆尽。最终只剩下含有山羊支原体细胞质，但由合成 DNA 控制的人工嵌合体细胞。虽然蕈状支原体和山羊支原体在基因组上 75%是同源的，但该人造细胞明显表现出蕈状支原体的生长特性。上述结果也表明，专一的 DNA 序列足以识别具有不同特性的活细胞。在研究中发现，一个必需基因的百万以上的碱基中即使一个错误也会使得基因组丧失活性；但在基因组的非必需部分中，插入或删除大量的基因对细胞的生存也没有明显的影响。该人造基因组相比于天然基因组， 有 14 个非必需基因被删除或扰乱， 然而其细胞在琼
9、脂平板上群体的数量和形态都没有明显改变。讨论：讨论：传统的基因组工程一般都是通过在天然基因组上引进多重的基因插入、替换和删除而实现的。 这篇论文中化学合成基因组的方法或许在预示着 “数字生命时代” 的到来， 而 DNA测序就是把基因结构贮存在计算机中作为一个 “数字生命。 ” 尽管这种方法仅仅在蕈状支原体上实现，但相信随着基因组绘制的进步，将会发展为合成和移植更多奇幻的基因组的划时代的新技术。这种“人造细胞”有点美中不足的是，细胞质不是人造的。值得安慰的是，随着人造基因组的不断复制，蛋白质等物质会不断更新，也就是说，某个子代细胞的细胞质将会完全没有原始细胞质的任何成分，而是组装的基因组表达出来的。换句话说，人造基因组必将得到人造细胞，即 DNA 软件构建自己的硬件。值得一提的是，为了区分人造基因组与天然基因组的表达产物，因研究需要而添加了“水印”基因，这对他们的大量研究工作做出了巨大贡献。由此，将揭开合成生物学的时代。只要这篇论文介绍的方法被推广，人造基因组的设计、 合成、 组装和移植将不再是合成生物学的障碍。 他们希望， DNA 合成的花费能够像 DNA测序一样指数型地下降，因为低耗的合成和全自动技术将会促使“人造基因组”被广泛地应用。最后，对于早已引发的合成生命的伦理问题，他们保持乐观的态度，并且鼓励做深入的交流讨论。
