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1、高效毛细管电泳的扩散进样陈义竺安（ 中国科 学院化学研究 所， 北京， 1 0 0 0 8 0 ） 提 要 本文 提出了 用扩散作为高 效毛 细管电 泳的进样方法， 解释了 此法的 原理。 用 扁管区 带电 泳法 研究了 扩散进样对电 泳效率的影响、 歧视问题及其抗样品基质干 扰的能力， 并与常用的电迁移法和虹吸法进行了比较， 指出了扩散进样的缺点。高效毛细管电泳（ H P C E ） 的效率与很多因素有 关 ， 其中 进样方 法是最 重要的因素 之一， 它 决定 初始区带的宽度和分布形式， 进而影响效率及定性定量结果。 目前已用的方法有： 微量注射器、 进样阀、 电 分流、 电 迁移( E
2、M ) 和虹吸( S ip h ) 等 法 2 。 前三 法有死 体积和泄漏问题。注射器与进样阀只可用于内径 1 0 0 蘭 m以 上的毛 细管， 且电 泳效率低。 E M法与S p h法将样品直接引入毛细管， 操作容易， 是最常用的方 法。但E M法， 尤其是S ip h 法， 抗样品基质干扰能力差， E M法还存在严重的样品歧视（ 见后文） 。我们提 出的扩散（ D i f f ） 进样法， 在一定程度上克服了这些问题。 本文报告 D i f f 法的原理及用扁管区带 电泳 ( F C Z E ) 3 测到的结果。方法原理当将装好载体的毛细管插进样品杯时， 因管口 处存在浓度梯度， 样品便
3、扩散进入管中。 可用 F i c k 扩散定律描述这种过程：C 和D分别为样品的浓度和扩散系数； ti为 进样时 间； Z轴指向管的深处， 原点在管口平面中心上。因H P C E 所需的进样量很小， 不影响样杯中的浓度 C,故有：此即自由扩散条件。若不计 D与C的关系， 方程( 1 ) 的 解 为 ：为 正 态 分 布 函 数 。 由 此 可 知 扩 散 初 始区带具有图 1 所示的分布形式。其平均浓度为：为确定Z 蓿 ， 我们略去C / C D 5 1 0 - 5牟糠郑 正 态 分 布 表 查 得 ：用梯形近似求和法， 即：其中略写了变量， n 为 求和步数， 令 n =4 0 ， 有：对(
4、 3 ) 求导可得初始区带的几率函数， 进而求得标准方差为：于是有绝对进样量公式S 为毛细管截面积， C 的单位取 m o l / L ， 其余用 M . S . k g 单位。E M和 S i p h 法的初始区带一般作均匀分布处理 亦 即 2 , 7 ：其中上、 下标 E S表示 E M和 S i p h ; L 为初始区带 宽度； V im 为进样速度， 对于 E M和 S i p h 法分别为 2 :为样品淌度， 蘯为电 渗率， E i 为进样电场强度； h 为液柱高 度， K与毛细管的长度、 截面积及管中载体的粘度、 密度有关， 在选定系统下是一常数。 实验部分 （ 一） 实验装置实
5、 验装置如图2 所示。 其 中扁管是 自 制的F E P （ 聚乙烯丙烯氟化物） 管 6 ， 规格 为 0 . 2 0 . 6 5 6 0 0 / 8 0 0 m m 。 直流高压电 源为美国 S p e llm a n 公司的R E R 4 0 P N型。 检测器为瑞典L K B 公司的2 2 3 8 U V C O R D S 型。 大孔圆 管 7 用于S ip h进样及开管电泳。 （ 二） 洗涤毛细 管分别用3 m l 三蒸水及l m l 载体由 注射 筒推 洗， 每次电 泳 后用 l m l 载体冲洗。 每 5 次电 泳 后更换一 次电 极槽中 载体。（ 三） 进样旋转阀门1 0 连通
6、管7 与 管4 ， 调整样品 杯高 度使其液面与 管下游液面严格水平， 将管4 开口 端插入样品杯中， 任其扩 散即是D if f 法； 如加电压则为E M法； 若将管 7 取出并降低管口 高 度便为S ip h 法。 一定时间 后复原系 统， 移 走样品 杯便能加压电泳。 （ 四） 试剂 ME S（ 吗啡啉乙磺 酸） 及M O P S （ 吗 啡啉丙磺酸） 为 日 本同仁化学研究所赠品， H P M C （ 羟 丙基甲 基 纤维素， 型） 为美国S ig m a 公司产品， T r is 及其他试剂均为 A . R . 级 ， 成都化学试剂厂出品。 所有载体均用三蒸水配制。 结果与讨论 （
7、一） 电泳效率进样方法对电 泳效率的影响主要取决于区带的初始方差 2 和样品与载体的浓 度比 。 值 反映了 进 样方法的 抗区 带电 场畸 变6 ,8 能力， 值越小能力越强， 反之亦然。 和 均以近指数衰减形式影响效率， 但它们的贡献不是并行的， 当 ( ) max2 1 0 - 7 m时， 椎 的贡献可略， 反之， 的作用占主导地位 6 。由( 5 ) 、 ( 7 ) 、 ( 9 ) ， 在 Q D =Q E S 时， 我们有：显然， D if f 的 。 可能大于E M或S ip h 法， 但 D 总小于后两法 ：这说明D i f f 法有很强的抗区带电场畸变能力， 可望获得高效率。实
8、验表明， 在第一种情况下， 若 ( ) m a , D i f f 法的效率确实不如 E M或S i p h 法， 但当 1 0 - 6 m后， D i f f 法的效率即可高于 E M 或 S i p h法 。 对于第2 种情况， 测定表明， 只要C D0 2 . 5 C 就可使 D i f f 的效率高于E M或S i p h 法。 图 3 是在 CD0 =2 . 8 0 C E S 时测定的F C Z E 结果， D if f 法的效率比 E 法高 1 / 2 倍以上。而比 S i p h 法高 1 倍以上， C D0 / C 的实测值小于 理论值的原因在于： S ip h 法和E M
9、法的抗样品基质干扰能力差（ 见后文） 。 另外， 它们的区带经历了静止一运动（ 进样） 静止（ 停止进样） 运动（ 电 泳） 的不连 续过程， 出现了 惯性加宽作用， 使 E S 大于理论值。而扩散过程总是存在的， 这种加宽效应很小。 （ 二） 歧视现象与峰的重现性所谓歧视现象是指混合物在进样时， 因各组分的进样速度不同而引起进样量不同的现象。从( 1 0 ) 式可知， E M法 存在严重的 歧视现象。 因 为不 同组 分的 m 差别非常大， 极限情况如正、 负离子的差别。 S i p h 法的 V i 与样 品性质无关 ， 无歧视问 题。根据( 7 ) 式， d i f f 也存在组 分 歧
10、 视， 但因Q D ， 缩 小 了 组 分 间 的 差 别， 并 且扩散方向与组分的电荷性质无关， 所以歧视程度很 小。由图3 的相对 峰高 可见， D if f 与S ip h 法很接近， 而 E M法则大不相同。E M法这种严重的组分歧视， 容易造成峰的丢失或大淌 度组分 值过大， 从 而大 大降低电 泳效率， 并导致保留 时间t R 难以确定8 ， 即重现性变差。（ 上接第3 4 0 页） 研究、 发展毛细 管电 泳的毛 细管柱、 生 物工程下游处 理的径向柱以 及新型细内 径色谱柱成为 讨论的焦点。 讨论中， 突出了 要加强 柱的 研制国产化。 会议共评出了1 5 篇优秀 论文（ 请见
11、 色谱 杂志第9 卷： 第4 期第1 4 篇， 第6 篇， 第9 1 1 篇，第 1 3 篇； 第5 期第2 6 篇； 最后一 篇见八次色 谱文集第4 0 1 页） 。 会议期间召 开了 色谱杂志 编委会及 色谱学会理事 会。 方树华同 志被评为 优秀编辑， 张玉 奎同 志被增 补为色谱杂志 副样品基质的组成及进入毛细管中的量是影响重 现性的另 一重要因 素9 。 使用D if 法时， 不 管基质的组成如何， 只有存在浓差的组分才可进入管中， 且进入的量十分有限( 1 0 - 1 0 m o l ) ， 因而 D i f f 法有强的抗基质干扰能力。 相反， S i p h 法要把样品及其基质
12、原样引入管中， 在有电渗流时， E M法也会大量引入基质，这就造成了区带与背景的严重差别， 干扰了分离过程。 在载体浓度很低或进样体积较大时， 基质的干扰 非常突出。 图 4 是在样品浓度较低、 进样体积较大时的F C Z E 实验结果。显然， 样品基质除对D i f f 的峰高有 一定影响外， 不改变峰的形状和t R ， 而对S ip h 或E M法的峰高、 峰形、 t R 以及基线都有严重的影响。 一般，只有水配样品才能使 E M法或 S i p h 法得到较理想的 结果。 这是因 为水配样获 得的 初始区 带的电 导小于 背景载体， 电泳时承受了较高的电场强度， 使样品迅速离开初始环境进
13、入高电导区。 在进入高电导区时， 样品前沿因 速度下降产生了 类似于等速电 泳的锐化效应 1 0 。 不过， 即使在水配样品条件下， D i f f 法 因进样时间长、 进样误差小亦更容易获得高重现性（ 见表 1 ） ， 而E M法， 特别是S i p h 法的进样时间以秒计， 易 产生大的进样误差。 当然自 动进样时能减少其误差 。表1 D i f f 法与E M 、 S i p h 之F C Z E 重叵现 性比 较* （ 一） 定量效果用对氨基苯磺酸水溶液进行 F C Z E 测定表明， D if f 法的 外标校正曲 线和线 性范围 比E M法大约 1 个数量 级， 与S ip h 法
14、相 近， 且 截距趋 进原点。E M法和S i p h 法的截距偏离原点较远， 原因还不清楚。在线性范围内， D i f f 法关于C- S p 和C- h p 的线性相关系数分别是0 . 9 9 9 9 和0 . 9 9 9 8 ; E M法分别为 0 . 9 9 8 5 和 0 . 9 9 2 0 ; S i p h 法分别 鹞 为 0 . 9 9 8 0 和 0 .9 9 1 5 。D i f f 法明显优于其他两法， 特别是 D i f f 法的 C - h p 的良 好线性关系， 给定量 工作 带来很大的方便。定量曲线的详细情况见图 5 。（ 四） 注意事项使用D i f法时要严格使
15、样品 液 面与 下游液面水平并 且需要比E M 、 S ip h 法长2 倍的间歇时间 1 1 ， 以保证管中没有任何液体流动。 这种限 制， 加上较长的进样时间， 使D i f f 法的分析速度大大降低， 这是一大缺点。 结论 尽管D if f 法影响分析速度， 但它具有强的抗样 品基质干扰和抗区带 电场畸变能力、 较好的定量特性， 是值得推荐的方法。另外它和E M法一样可以用于毛细管凝胶电泳及电色谱 1 2 的进样， 而 S i p h 法则只能用于有流动性的载体条件。参考文献 1 陈 义、 竺 安， 色谱, 8 , 1 5 9 ( 1 9 9 0 ) . 2 D . JR o s e e
16、 t a l, A n a l C h e m , 6 0 , 6 9 2 ( 1 9 8 8 ) . 3 陈义、 竺安 ， 第七届全国色谱学术报告会文集. 6 1 3 页， 北京， 1 9 8 9 . 4 北京大学化学系讲义， 分散 体系物化 , 1 7 页. 1 9 8 6 年 秋 GAC o h e n e t a l , 数 学手 册 （ 周民强等译） ， 工人出版 社， 北京， 1 9 8 7 . 6 陈 义， 中 国科学 院化学研究所 博士论文， 1 9 9 0 . 7 X H u a n g e t a l . , JC h r o m a t o g r, 9 8 0 , 9 5 ( 1 9 8 9 ) . 8 F E P M i k k e r s e t
