《动物性食品中环境雌激素残留的检测与分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动物性食品中环境雌激素残留的检测与分析（59页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 分分 类类 号号 学学 号号 M201075007 学校代码学校代码 10487 密密 级级 硕硕士士学学位位论论文文 动物性食品中环境雌激素残留的动物性食品中环境雌激素残留的 检测与分析检测与分析 学位申请人：学位申请人： 王王 君君 学科专业学科专业 ： 卫生检验与检疫卫生检验与检疫 指导教师指导教师 ： 王王 琳琳 副教授副教授 徐顺清徐顺清 教授教授 答辩日期答辩日期 ： 2012013 3 年年 1 1 月月 A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of M
2、aster of Medicine Detection and analysis of environmental estrogens residues in animal source food Candidate: Wang Jun Major: Health Inspection and Quarantine Supervisor: Vice. Prof. Wang Lin Prof. Xu Shunqing Tongji Medical College Huazhong University of Science N = 142) was found between the EEQch
3、em. and EEQbio. Key words: Environmental estrogen; Yeast estrogen screen; HPLC/MS/MS; Animal foodstuff; Estrogenic activity 4 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 全文缩略词 EES environment estrogens 环境雌激素 ESR YES SPE E1 E2 E3 EE2 DES BPA 4-NP 4-t-OP MS HPLC EEQ EEF DMSO ONPG estrogen receptor yeast estro
4、gen screen solid phase extraction estrogen 17-estradiol estriol 17-ethinylestradiol diethylstilbestrol bisphenol A 4-nonylphenols 4-t-octylphenol mass spectrometry high performance liquid chromatography estradiol equivalent estradiol equivalent factor dimethyl sulfoxide O-Nitrophenyl-D-Galactopyrano
5、side 雌激素受体 重组基因酵母筛检法 固相萃取法 雌酮 雌二醇 雌三醇 乙炔基雌二醇 己烯雌酚 双酚 A 壬基酚 辛基酚 质谱法 高效液相色谱 雌二醇当量 雌二醇当量因子 二甲基亚砜 邻硝基苯-D-半乳吡喃 糖苷 5 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 前前 言言 环境雌激素（environmental estrogens，EES）包括自然界中存在的天然雌激素和人工合成的多种外源性雌激素，它们在人和动物体内可以直接或间接干扰正常内分泌物质的合成、释放和代谢等过程，导致神经系统、生殖功能及免疫力等出现一系列异常症状1。由于环境雌激素对整个生态系统的危害效应
6、具有极大的广泛性和持久性，环境雌激素问题已经成为继温室效应、臭氧层破坏之后又一世界重大环境问题，引起世界各国学者和政府机构的高度重视2, 3。 在环境中具有雌激素活性的物质主要分为两大类：内源性雌激素和外源性雌激素。内源性雌激素主要包括动物和人体分泌的雌激素，如雌二醇、雌酮、雌三醇等4；植物雌激素，如木聚糖、黄酮类等5；还有真菌性雌激素，如玉米赤霉烯酮等6。它们是自然界中存在的天然雌激素，一般通过动物的排泄及植物的分泌途径释放到环境中。研究发现，女性每天排泄 212g 左右的雌二醇，孕期妇女每天排泄 259g 左右的雌二醇7。人工饲养的动物每日可排泄 14360g 左右的雌激素。故全球动物每年
7、排泄激素总量可高达 49 吨8。外源性雌激素主要包括合成雌激素，如乙炔基雌二醇、己烯雌酚等9；工业化学品，如烷基酚类，多氯联苯类、邻苯二甲酸酯类、农业化学品类、金属化合品类等10。这些物质主要通过日常生活中清洁剂的使用，塑料和垃圾物品的燃烧，工业化学品的使用，农药使用和残留等途径排放到环境中，污染水体、空气和土壤等。目前，在美国、中国、日本、韩国以及西班牙等国家的水体、底泥中，这些物质都有不同程度的检出11, 12。 环境雌激素对生物健康具有严重危害。有学者研究发现，环境雌激素可以影响人类和野生动物的生殖系统，欧洲、日本及中国等多个地区曾捕获到罕见的雌雄同体鱼13；成年男性精子的数量、质量也存
8、在异常情况14；女性则出现青春期提前、月经失调、子宫内膜增生等异常现象。长期接触环境雌激素可引起机体免疫失调和病理反应15。一些环境雌激素具有亲脂性，易穿过血脑屏障进入到脑组织，对中枢神经系统产生直接毒性作用，出现精神和行为的异常等16。 环境雌激素类物质种类繁多、 数量庞大， 并且每年还会有大量新的化合物被发现，6 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 因此如何全面准确地对环境雌激素进行检测，对检测方法提出了更高的要求。目前常用的检测方法主要有：化学分析法，如高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法等。生物分析法，如重组基因
9、酵母筛检法、子宫生长实验、肝细胞卵黄蛋白原生成实验、人乳腺癌细胞增殖实验等。化学分析法具有较高的选择性，但仪器昂贵，费用较高，并且只能对已知的目标物进行分析，不能反映多种化合物同时存在时可能产生的相加、协同或拮抗作用，在一定程度上限制了其广泛的应用。生物学方法则可以弥补其不足之处，评价混合物总的雌激素效应，将两种方法有机结合，可以起到很好的互补效果。 随着人们对食品安全要求的不断提高，食品中环境雌激素的残留问题越来越成为关注的焦点。一方面大部分环境雌激素具有脂溶性，易在动物性食品中蓄积；另一方面在动物养殖过程中，为了促进其生长，提高产量，会人为的添加一定量的激素类物质。因此，动物性食品中环境雌
10、激素残留检测成为目前的热点问题。 本论文采用生物分析方法对中国四个城市居民经常食用的 16 种动物性食品总的雌激素活性进行评价，并结合化学方法分析样品中 8 种常见环境雌激素的含量，以便更有效的评价动物性食品环境雌激素的总体效应及污染现状。 本课题为国家自然科学基金重点项目（No.81030051）和国家重点基础研究发展计划（973 计划）项目（NO.2012CB722401）的部分研究内容。 7 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 第一部分第一部分 动物性食品中总的雌激素活性测定动物性食品中总的雌激素活性测定 1 1 引言引言 近年来，科学家调查发现，欧美
11、国家男性精子数量下降、异常精子数量增多，女性内分泌紊乱、月经失调等现象较为常见17, 18。除此之外，在对野生动物的调查中也发现了类似的现象，如雌雄同体鱼的出现、繁殖能力的下降、生殖器官的异常等19-21。研究认为，上述现象与某些具有雌激素活性作用的物质有关。 随着现代社会的发展，EEs 广泛应用于我们的日常生活中，如目前使用的农药中大约 70%-80%具有雌激素活性；增塑剂和清洁剂也大部分具有雌激素活性；在畜禽和水产养殖过程中，会广泛使用雌激素及其类似物，提高饲料转化率，促进动物的生长。大部分的 EEs 是亲脂性的化合物，所以极易在动物性食品中蓄积，并且人体暴露于 EEs 的主要途径是通过食
12、物的摄入22， 因此对动物性食品中 EEs 的检测具有重要意义。 由于动物性食品中具有雌激素活性的物质种类繁多， 情况复杂， 通常以多种 EEs混合形式存在，并且各物质间对机体的影响相差悬殊，如何对该类物质进行定量分析及风险评价是一个十分棘手的问题。单一的化学分析方法通过逐一对每一种 EEs进行分析的传统定量评价模式已不能满足食品安全评价的需要。在某些情况下虽然经过对每一种 EEs 进行逐一的定量检测均未发现超过限量标准，但是多种 EEs 共存相互作用的叠加积累效应却远远超出了相关标准，其累计效应已经对机体产生了潜在的毒性作用。因此，国际上环境雌激素用雌二醇当量（estradiol equiv
13、alent，EEQ）来表示其雌激素效应的强弱。而且，评价接触这些混合 EEs 对健康产生的潜在效应并非其含量简单相加，而是包括了相加、协同、拮抗等多种联合作用共存。生物测试技术恰为这一检测需求提供了可能，其能反映多种 EEs 的相加、协同和拮抗等联合作用，从而更准确评价这些混合 EEs 对健康影响的潜在效应。 重组基因酵母筛检法（Yeast Estrogen Screen，YES）是近年来常用的一种检测环境雌激素的方法，常用于水质、底泥23-25等环境样品雌激素活性的评价，该方法已被许多研究者认可。本实验中使用的重组基因酵母本身没有雌激素受体，是将人8 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕
14、 士士 学学 位位 论论 文文 的雌激素受体（estrogen receptor，ESR）基因、雌激素效应元件及 Lac-Z 报道基因（编码 -半乳糖苷酶）重组于酵母细胞26。如果受试物具有雌激素样作用，就可与雌激素受体相结合，Lac-Z 报道基因被激活，生成 -半乳糖苷酶，该酶可使底物邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷（O-NPG）呈黄色。通过测定 -半乳糖苷酶的活性可以对待测物的雌激素活性进行定量测定27-29。实验整个操作简便，酵母细胞易于培养，实验室条件要求不高30。 2 2 实验部分实验部分 2.1 实验材料实验材料 2.1.1 实验试剂实验试剂 重组基因酵母测试方法测定雌激素活性所需实验主
15、要试剂见表 1-1。 2.1.2 实验仪器实验仪器 重组基因酵母测试方法测定雌激素活性所需实验主要使用仪器见表 1-2。 2.2 样品前处理样品前处理 2.2.1 样品采集样品采集 本实验选取武汉、广州、温州、烟台四个城市作为样品的采集地点。于 2011 年 5月至 2012 年 4 月期间，在这四个城市各大超市和集贸市场进行食品的采样，根据当地的膳食习惯，采取当地居民经常食用的动物性食品作为此次检测对象。所采集的样品具体包括：家畜（猪肉、牛肉） 、家禽（鸡肉、鸭肉） 、水产品（鲫鱼、鳝鱼、鳙鱼、草鱼、鳊鱼、鳊鱼、带鱼、鲳鱼、小黄鱼、鲈鱼） 、鸡蛋等 15 种。 从可食用的部位采取少量样品混匀绞碎，存放在棕色广口玻璃瓶中，密封好，做好标记，注明采样时间、采样地点等，保存在-20的冰箱。 2.2.2 样品提取样品提取 样品前处理过程见文献31, 32，同时进行了一定的改进。称取 5.00 g 样品于 50 mL离心管中，加入 10 mL 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH=5.2） 、100L -葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液涡旋混匀，37酶解过夜。 次日加入 20mL 乙酸乙酯溶液进行提取，超声离心，上清液转入新的离心管中；9 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学
