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1、四川省食品药品检验检测院四川省食品药品检验检测院 孙雪奇孙雪奇 20162016年年6 6月月 北京北京1105 1105 非无菌产品非无菌产品微生物限度检查：微生物限度检查： 微生物计数法微生物计数法一、培养基适用性一、培养基适用性二、方法适用性二、方法适用性三、样品检验三、样品检验一、培养基适用性一、培养基适用性1 1、菌种、菌种2 2、培养基适用性检查、培养基适用性检查3 3、菌液制备、菌液制备4 4、培养及可接受标准、培养及可接受标准胰酪大豆胨琼脂胰酪大豆胨琼脂 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞铜绿假单胞、白色念珠菌、黑曲菌白色念珠菌、黑曲菌胰酪大
2、豆胨液体（胰酪大豆胨液体（MPNMPN法法） 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞沙氏葡萄糖琼脂沙氏葡萄糖琼脂/ /其他选择性培养基（如含抗生素的沙氏其他选择性培养基（如含抗生素的沙氏 葡萄糖琼脂玫瑰红钠琼脂）葡萄糖琼脂玫瑰红钠琼脂） 白色念珠菌、黑曲菌白色念珠菌、黑曲菌1 1、菌种、菌种4名称名称胰酪大豆胰酪大豆胨胨琼脂琼脂试验用菌种试验用菌种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色 念珠菌、黑曲霉念珠菌、黑曲霉接种方法接种方法 （变化不大）（变化不大）分别接种不大于分别接种不大于100cfu
3、100cfu试验用菌悬液于直径试验用菌悬液于直径90mm90mm的无菌的无菌 平皿中平皿中，倾注约，倾注约15ml15ml该培养基，轻轻摇匀该培养基，轻轻摇匀判断标准判断标准适用性检查：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假适用性检查：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌单胞菌于于30303535培养不超过培养不超过3 3天；白色念珠菌、天；白色念珠菌、黑曲黑曲霉，霉，于于30303535培养不超过培养不超过5 5天。天。被检培养基菌落平均被检培养基菌落平均数数/ /对照培养基菌落平均数的比值，应在对照培养基菌落平均数的比值，应在 0.520.52 ，且菌且菌 落大小、形态一致落大小、形态
4、一致。2 2、培养基适用性检查、培养基适用性检查2016-6-135TSATSA培养基适用性试验流程培养基适用性试验流程提前提前1 1天接种天接种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜 绿假单胞菌、白色念珠菌绿假单胞菌、白色念珠菌( (黑曲霉使用孢子悬液黑曲霉使用孢子悬液) )稀释菌液至适宜浓度稀释菌液至适宜浓度准备待检培养基和对照培养基准备待检培养基和对照培养基接种菌液入平皿接种菌液入平皿加入培养基，混匀加入培养基，混匀置规定温度培养、计数置规定温度培养、计数名称名称沙氏葡萄糖琼脂沙氏葡萄糖琼脂 / /选择性培养基选择性培养基 试验用菌试验用菌 种种白色念珠菌白色念
5、珠菌、黑曲霉、黑曲霉接种方法接种方法 接种接种大于大于100cfu100cfu试验用菌悬液于直径试验用菌悬液于直径90mm90mm的无菌平的无菌平 皿中皿中, ,倾注约倾注约15ml15ml该培养基，轻轻摇匀。该培养基，轻轻摇匀。判断标准判断标准适用性检查：白色念珠菌、黑曲霉适用性检查：白色念珠菌、黑曲霉于于20202525培养培养 不不超过超过5 5天。天。被检培养基菌落平均数被检培养基菌落平均数/ /对照培养基菌对照培养基菌 落平均数的比值应在落平均数的比值应在 0.520.52 ，且菌落大小、形态一且菌落大小、形态一 致致。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌、铜绿假
6、单胞菌、枯草芽孢杆菌用用胰酪胰酪 大豆胨琼脂或液体培养基大豆胨琼脂或液体培养基，制成，制成新鲜新鲜培养物，再以培养物，再以pH7.0pH7.0无菌无菌 氯化钠氯化钠- -蛋白胨缓冲液或蛋白胨缓冲液或0.9%0.9%无菌氯化钠溶液无菌氯化钠溶液制成菌悬液制成菌悬液白色念珠菌白色念珠菌用用沙氏葡萄糖琼脂或液体培养基沙氏葡萄糖琼脂或液体培养基，制成新鲜培，制成新鲜培 养物，再以养物，再以pH7.0pH7.0无菌氯化钠无菌氯化钠- -蛋白胨缓冲液或蛋白胨缓冲液或0.9%0.9%无菌氯化无菌氯化 钠溶液钠溶液制成菌悬液制成菌悬液黑曲霉黑曲霉用用沙氏葡萄糖琼脂沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂培养基或马铃薯
7、葡萄糖琼脂培养基，培，培 养养5-75-7天，加入天，加入3 35ml5ml含含0.05%0.05%聚山梨酯聚山梨酯8080的的pH7.0pH7.0无菌氯化钠无菌氯化钠 - -蛋白胨缓冲液或蛋白胨缓冲液或0.9%0.9%无菌氯化钠溶液无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用相同，将孢子洗脱，用相同 稀释剂制成适宜浓度菌悬液稀释剂制成适宜浓度菌悬液 3 3、菌液制备、菌液制备2016-6-138胰酪大豆胨琼脂胰酪大豆胨琼脂 胰酪大豆胨肉汤胰酪大豆胨肉汤 沙氏葡萄糖琼脂沙氏葡萄糖琼脂培养温度培养温度303035353030353520202525培养时间培养时间不不超过超过3 3天天不不超过超过3 3天天不
8、不超过超过5 5天天可接受标可接受标 准准形态大小形态大小 0.50.52 2生长良好生长良好形态大小形态大小 0.50.52 24 4、培养及可接受标准、培养及可接受标准二、计数方法适用性二、计数方法适用性2016-6-13101 1、方法适用性试验分组方法适用性试验分组2 2、接种和稀释、接种和稀释 3 3、试验菌种及培养基、试验菌种及培养基4 4、方法适用性试验、方法适用性试验5 5、抗菌活性的去除或灭活、抗菌活性的去除或灭活试验用菌株的培养、菌悬液的稀释同培养基适用性试验用菌株的培养、菌悬液的稀释同培养基适用性(1)(1)总需氧菌计数用总需氧菌计数用5 5种菌株种菌株试验试验(2)(2
9、)液体培养基计数液体培养基计数(MPN(MPN法法) )用用3 3种菌株种菌株试验试验(3)(3)霉菌和酵母菌总数计数用霉菌和酵母菌总数计数用2 2种菌株试验种菌株试验一般，方法的适用性试验分为一般，方法的适用性试验分为试验组试验组菌液对照组菌液对照组样品组样品组阴性对照组阴性对照组如果使用中和剂或者灭活剂如果使用中和剂或者灭活剂1 1、方法适用性试验分组、方法适用性试验分组试验组试验组 取供试液，加入菌液进行计数。取供试液，加入菌液进行计数。供试品对照组供试品对照组 供试液，供试液，以稀释剂代替菌液以稀释剂代替菌液按照试验组按照试验组 操作进行计数（操作进行计数（1%1%差距可忽略）差距可忽
10、略）菌液对照组菌液对照组 取不含中和剂、灭活剂及表面活性剂的稀取不含中和剂、灭活剂及表面活性剂的稀 释液加入规定量的菌液，计数释液加入规定量的菌液，计数阴性对照组阴性对照组 稀释液，不加菌液按照试验组操作进行试稀释液，不加菌液按照试验组操作进行试 验。验。中和剂、灭活剂、表面活性剂对照组中和剂、灭活剂、表面活性剂对照组 含中和剂、灭活含中和剂、灭活 剂及表面活性剂的稀释液中加入规定量菌液，按试验剂及表面活性剂的稀释液中加入规定量菌液，按试验 组操作进行计数。组操作进行计数。薄膜过滤法：最后加菌薄膜过滤法：最后加菌修订前修订前修订后内容修订后内容备注：备注：主要针对平皿法主要针对平皿法1 1试验
11、组试验组菌液菌液+ +样品样品一般一般，供试品加稀释液制成供试品加稀释液制成1:101:10供试液。供试液。 取供试液，加入试验菌液，使每取供试液，加入试验菌液，使每1ml1ml供供 试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌 量不大于量不大于100cfu100cfu。2 2供试品供试品 对照组对照组供试液直接加入平皿供试液直接加入平皿 中。中。取供试液，以稀释液代替菌液同试验组取供试液，以稀释液代替菌液同试验组 进行试验。进行试验。3 3菌液菌液 对照组对照组直接加入菌液到平皿直接加入菌液到平皿 中。中。取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替取不含中和剂及灭活剂的相应稀
12、释液替 代供试液，按照试验组操作加入试验菌代供试液，按照试验组操作加入试验菌 液并进行微生物回收试验。液并进行微生物回收试验。中和剂中和剂 或灭活剂或灭活剂 对照组对照组稀释剂对照组稀释剂对照组取含中和剂、灭活剂及表面活性剂的稀取含中和剂、灭活剂及表面活性剂的稀 释液替代供试品，按照试验组进行试验，释液替代供试品，按照试验组进行试验， 以确认有效性与无毒性。以确认有效性与无毒性。若使用若使用2 2、接种和稀释、接种和稀释 3 3、试验菌种及培养基试验菌种及培养基 根据表根据表1 1第四栏：第四栏： 1 1、需氧菌总数方法适用性试验、需氧菌总数方法适用性试验非非MPNMPN法法菌：金黄色葡萄球菌
13、、枯草芽孢杆菌、铜菌：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜 绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲菌绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲菌培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基：胰酪大豆胨琼脂2 2、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验菌：白色念珠菌和黑曲菌菌：白色念珠菌和黑曲菌培养基：沙氏葡萄糖琼脂培养基：沙氏葡萄糖琼脂/ /玫瑰红玫瑰红钠琼脂等选择性钠琼脂等选择性 培养基培养基供试液制备供试液制备根据供试品的理化特性与生物学特性根据供试品的理化特性与生物学特性，以及微生，以及微生 物限度标准，采取适宜的方法制备供试液物限度标准，采取适宜的方法制备供试液4 4、方法适用性试验、方法适用性试
14、验7份每份份每份 10ml+ 0.1ml+ 0.1ml黑曲霉菌液黑曲霉菌液+ 0.1ml+ 0.1ml白色念珠菌液白色念珠菌液+ 0.1ml+ 0.1ml枯草芽孢杆菌液枯草芽孢杆菌液+ 0.1ml+ 0.1ml金黄色葡萄球菌液金黄色葡萄球菌液+ 0.1ml+ 0.1ml铜绿假单胞菌液铜绿假单胞菌液1 试验组：试验组：采取适宜的方采取适宜的方 法制备合适的供法制备合适的供 试液试液使使1ml1ml供试液的菌数不大于供试液的菌数不大于 100cfu100cfu0.1ml0.1ml菌数不大于菌数不大于1000cfu1000cfu （1ml1ml不大于不大于1000010000 ) ) （终浓度（终浓
15、度 100cfu100cfu/ml/ml ）* *2 2* *2 2取供试液，用稀释液替代菌液，取供试液，用稀释液替代菌液， 同试验组同试验组 2供试品对照组：供试品对照组： 3菌液对照组：菌液对照组：不含中和剂、灭活剂不含中和剂、灭活剂 及表面活性剂的稀释及表面活性剂的稀释 液替代供试品液替代供试品7份每份份每份 10ml稀释液稀释液+ 0.1ml+ 0.1ml黑曲霉菌液黑曲霉菌液+ 0.1ml+ 0.1ml白色念珠菌液白色念珠菌液+ 0.1ml+ 0.1ml枯草芽孢杆菌液枯草芽孢杆菌液+ 0.1ml+ 0.1ml金黄色葡萄球菌液金黄色葡萄球菌液+ 0.1ml+ 0.1ml铜绿假单胞菌液铜绿
16、假单胞菌液0.1ml0.1ml菌数不大于菌数不大于1000cfu1000cfu （1ml1ml不大于不大于1000010000 ) ) （终浓度小于（终浓度小于100cfu100cfu/ml/ml ）* *2 2* *2 27份每份份每份 10ml稀释液稀释液+0.1ml+0.1ml金黄色葡萄球菌液金黄色葡萄球菌液+ 0.1ml+ 0.1ml黑曲霉菌液黑曲霉菌液+ 0.1ml+ 0.1ml白色念珠菌液白色念珠菌液+ 0.1ml+ 0.1ml枯草芽孢杆菌液枯草芽孢杆菌液+ 0.1ml+ 0.1ml铜绿假单胞菌液铜绿假单胞菌液稀稀 释释 液液中和剂、中和剂、 抑菌剂或抑菌剂或 表面活性剂表面活性剂稀释液稀释液 中和剂或灭活剂对照组：中和剂或灭活剂对照组：使使1ml1ml供试液的菌数不大于供试液的菌数不大于 100cfu100cfu0.1ml0.1ml菌数不大于
